Выделение и идентификация культуры возбудителя. Культивирование.С. chauvoei — строгий анаэроб, требует разрежения до 5-10 мм ртутно­го столба

Культивирование. С. chauvoei — строгий анаэроб, требует разрежения до 5-10 мм ртутно­го столба. Температурный оптимум 36-38° С. Посев на питательные сре­ды производят предварительно профламбированными кусочками тканей, жидкий материал высевают пастеровскими пипетками. В качестве пита­тельных сред используют среду Кита-Тароцци, кровяной агар (кровь овцы) с печеночным экстрактом глюкозо-кровяной агар Цейсслера. Для получения изолированных колоний посев мате­риала желательно производить на 3-4 чашки Петри.

Параллельно производят посевы на МПА и МПБ, для исключения аэробной микрофлоры. Несвежий материал целесообразно растереть в ступ­ке со стерильным физиологическим раствором (1:4), прогреть при 80° С в течение 15-20 минут и затем посеять на питательные среды. Рекомендует­ся также посев на МППБ с 0,5% карболовой кислоты. После инкубирова­ния и выявления споровых клеток в окрашенных препаратах со дна про­бирки пастеровской пипеткой отбирают 3-5 мл среды, прогревают до 60° С в течение 30 минут и рассевают на плотные среды.

При использовании метода посева в глубину сывороточного агара исход­ный материал (0,5 мл) засевают в пробирку с расплавленным и остуженным агаром, затем этой же пипеткой производят последовательный перенос мате­риала из этой пробирки еще в четыре пробирки с агаровой средой. Содержи­мое 4 и 5 пробирок переливают в трубки Виньял-Вейона. Выросшие колонии отвивают на среду Кита-Тароцци и глюкозо-кровяной агар. Посевы в чашках инкубируют в строго анаэробных условиях в анаэростатах, лучше с 10% СО₂ при 37° С в течение 2-4 дней, пробирки со средой Кита-Тароцци выдерживают в термостате 1-2 суток при 37° С.

Заключение о целесообразности обработки материала с целью деконта-минации от посторонней микрофлоры делают на основании результатов микроскопического исследования материала.

Характер роста возбудителя на питательных средах. На среде Китта-Тароцци рост С.chauvoei сопровождается равномер­ным легким помутнением среды, слабым газообразованием, через 2-3 суток среда просветляется и формируется рыхлый беловатый осадок. Старые куль­туры имеют запах прогорклого масла. Гнилостный запах и потемнение сре­ды указывают на загрязнение. Скорость спорообразования зависит от ряда факторов и может варьировать от 24 до 72 часов. При получении смешанной культуры проводят дробный посев на глюкозо-кровяной агар в чашках Пет­ри. В толще сывороточного агара возбудитель образует чечевицеобразные или круглые колонии с нежными отростками.

На кровяном агаре возбудитель формирует округлые колонии диамет­ром 0,5-3 мкм в большинстве случаев с небольшой зоной (β-гемолиза в виде «перламутровой пуговицы» (S-форма) или плоские с изрезанными краями в виде виноградного листа (R-форма). При посеве в мозговую среду последняя закисляется, есть газообразование, почернения нет, позднее в толще среды отмечает­ся легкое покраснение. В молоке с кусочками печени рост обнаруживается уже через 16-18 часов при свертывании молока на 3-6-е, иногда на 14-е сутки.

Морфология клеток возбудителя в культуре. Из выросших культур готовят мазки, окрашивают по Граму. Клетки в мазках прямые или слегка изогнутые, полиморфные. Располага­ются одиночно, парами, реже — цепочками, капсулу не образуют, перитрихи, споры овальные центральные или субтерминальные. В молодых культу­рах клетки возбудителя окрашиваются грамположительно, в старых име­ют тенденцию к грамотрицательной окраске.

Идентификация возбудителя на основании изучения ферментатив­ных свойств. Исследуемую культуру высевают на желточный агар, желатину, мо­локо, среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, салицином, проводят пробу на индол. Для C.chauvoei характерен гидролиз желати­ны, расщепление перечисленных углеводов с образованием кислоты, отсутствие утилизации салицина, образование лецитиназы, липазы, ка-зеиназы, индола. При исследовании ферментативных свойств, кроме классических сред и тестов, может быть использована система API20A для анаэробов (Analytab Products).

Биопроба. Проводят с целью выделения возбудителя из исследуемого материала или определения патогенных свойств выделенной культуры. Очистка загрязненного материала путем заражения мор­ских свинок менее эффективна, чем посев на плотные кровяные среды. Тка­невый материал растирают в ступке со стерильным МПБ (1:10), в объеме 0,5-1,0 м вводят подкожно в область брюшных мышц морским свинкам массой 350-400 г. За животными наблюдают в течение 8 суток. Гибель обыч­но наступает на 1-4-е сутки. При наличии в материале возбудителя на месте инъекции в коже обнаруживают кровоизлияния, геморрагический выпот. Кожа от пораженных мышц отделяется с трудом. Мышцы темно-красного цвета, в клетчатке немного газа, кишечник не вздут, желчный пузырь пере­полнен содержимым. Возможно наличие слабовирулентных штаммов, по­этому целесообразно внутримышечное введение материала с 1-2 каплями 20%-ого раствора молочной кислоты, подавляющей фагоцитоз. При под­кожном заражении кролик не погибает (дифференцирующий признак).

Путем микроскопии мазков-отпечатков из тканей на месте инъекции от­личить С. chauvoei от других возбудителей злокачественного отека доста­точно сложно, за исключением С. septicum, который образует на серозных покровах длинные нити.