Лабораторная диагностика рожи свиней

Рожа свиней — инфекционная болезнь, характеризующаяся при остром те­чении септицемией и воспалительной эритемой кожи, при хроническом — эндокардитом и артритами. Спорадически может встречаться у лошадей, крупного рогатого скота, овец, северных оленей, собак, диких млекопитающих, птиц, восприимчив человек.

Возбудитель бо­лезни — грамположительная палочковидная бактерия Erysipelothrix rhusiopathiae, относящаяся к роду Erysipelothrix.

Лабораторная диагнос­тика болезни основана на результатах бактериологического серологического исследования.

Бактериологическое исследование. В лабораторию направляют труп животного целиком или сердце (при хро­ническом течении - обязательно), печень, селезенку, почку, трубчатую кость. При артритах берут синовиальную жидкость. При необходимости материал консервируют 30%-ным стерильным водным раствором глицерина.

Микроскопическое исследование исходного материала. Из материала готовят мазки, окрашивают по Граму, а также люминесцирующими рожистыми сыворотками. При хроническом течении обязательно делают мазки с поверхности измененных клапанов сердца. В мазках, окра­шенных по Граму, в положительных случаях обнаруживают грамположительные, прямые или слегка изогнутые тонкие палочки размером 0,2-0,3 мкм шириной, 2,5 мкм длиной с закругленными концами, без спор и капсул. Клетки располагаются единично, группами, в виде коротких цепочек, не­которые под углом друг к другу.

В препаратах из пораженных клапанов сердца свиней (хроническое те­чение) возбудитель имеет нитевидную форму с тенденцией клеток к обес­цвечиванию.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Культивирование. Возбудитель болезни — E. rhusiopathiae является факультативным анаэ­робом, в первой генерации ведет себя как микроаэрофил. Температурный оптимум 36-37° С, оптимум рН 7,4-7,8. Культуры в S-форме лучше рас­тут при 33° С и рН 7,6-8,2; R-формы — при 37° С и рН — менее 7.Посев исследуемого материала может быть произведен на МПА, МПБ, оптимальными средами являются кровяной агар, среды с 5-10% сыворот­ки крови и 0,2-0,5% глюкозы.

Контаминированный материал, особенно при исследовании миндалин на носительство возбудителя, высевают на селективные среды: среда ESB, среда МВА, среды, содержащие 0,1% азида натрия и 0,001% кристаллвиолета. Рекомендуется в этом случае делать посев на среду ESB с последующей пересевом на среду МВА. Жидкий материал рекомендуется центрифугировать, а седимент ресуспендировать в среде ESB. Если время не является лимитирующим фактором, рекомендуется инкубировать образцы тканей в флаконах с бульоном при 4-5° С в течение 4-5 недель, субкультуры засеять на среду МВА. Этот метод особенно подходит для выделения возбудителя из миндалин и кишеч­ных лимфатических узлов. Прямой посев материала на плотные среды обыч­но менее эффективен и дает удовлетворитель­ные результаты при использовании плотных селективных сред с кровью или сывороткой крови.

Характер роста возбудителя на питательных средах. На плотных средах возбудитель через 24-48 часов формирует мелкие (0,2-1,5 мм), круглые, выпуклые, прозрачные колонии с гладкой, блестя­щей поверхностью и ровными краями (S-форма). R-колонии менее выпук­лые, с неровными краями и тусклой поверхностью. Кроме R-колоний могут встречаться промежуточные SR-формы. На кровяном агаре через 24 часа обычно формируются негемолитические колонии, спустя 48 часов может появиться узкая зона а -гемолиза. При посеве в МПЖ и культивировании в течение 3-5 дней при 22° С возбудитель растет в виде «лампового ерши­ка» без разжижения желатины. Для просмотра посевов на плотных пита­тельных средах лучше пользоваться стереоскопическим микроскопом.

В МПБ рост возбудителя сопровождается очень слабым помутнением сре­ды без пристеночного кольца, пленки. Через 48-72 часа на дне пробирки появляется осадок, поднимающийся при встряхивании в виде облачка. На среде ESB посевы рекомендуется инкубировать не менее 48 часов.

Морфология Е. rhusiopathiae в культуре. В мазках из колоний

S-формы преимущественно находят палочковидные клетки (прямые или слегка изогнутые) размером 0,2-0,4 х 0,5-2,5 мкм, не обладающие подвижностью; из колоний R-формы — клетки типичной мор­фологии, а также цепочки из клеток и нити, которые могут достигать 4-15 мкм. Для выявления жгутиков культуру высевают уколом в полужидкий агар и инкубируют посевы 24 часа при 37° С. При обнаружении в первичных посевах культур с типичными для эризипелотриксов культуральными, мор­фологическими и тинкториальными свойствами их отвивают для дальнейше­го изучения.

Ферментативные свойства эризипелотриксов. Род Erysipelothrix включает два вида: Е. rhusiopathiae и Е. tonsillarum, однако по фенотипическим свойствам эти виды неразличимы и могут быть дифференцированы только путем изучения го­мологии ДНК. Пока единственным выявляемым фенотипическим отличи­ем Е. tonsillarum является принадлежность всех известных штаммов этого вида к седьмому серовару. Следовательно, идентификация на родовом и видовом уровне представляет собственно видовую идентификацию Е. rhusiopathiae. Некоторые критерии дифференциации эризипелотриксов от сходных групп бактерий представлены в разделе «Листериоз».

У выделенных культур определяют способность образовывать каталазу, оксидазу, сероводород, уреазу, гидролизовать эскулин, ферментировать уг­леводы. Для выяснения сахаролитической активности применяют 1%-ную пептонную воду с добавлением 5-10% стерильной сыворотки крови лоша­ди или кролика. Образование сероводорода целесообразно проводить посе­вом на среду Клиглер с учетом результата через 24 часа, хотя можно исполь­зовать и бумажки, пропитанные уксуснокислым свинцом.

Возбудитель не вырабатывает каталазу, оксидазу, уреазу, не гидролизует эскулин, образует сероводород.

Е. rhusiopathiae расщепляет с образованием кислоты без газа глюкозу, лак­тозу, декстрин, левулезу, галактозу, фруктозу, мальтозу; слабое образование кислоты регистрируется в средах с маннозой, иногда сахарозой. Обычно воз­будитель не образует кислоту из сорбита, маннита, инозита, дульцита, рамнозы, сорбозы, глицерина, эритрита, амигдалина, салицина, трегалозы, инули­на, мелицитозы, раффинозы, гликогена, ксилита, эскулина, целлобиозы. Ин­дол не образует и не редуцирует нитраты. Желатин не разжижает, не утилизи­рует цитраты, тест Фогес-Проскауера — отрицательный. Негидролизует гиппурат натрия, твин-20, 40, 80. Вирулентные штаммы Е. rhusiopathiae образуют гиалуронидазу, но обычно этот тест в диагностичес­кой практике не используют.

Согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на рожу свиней» (1984) во внимание при идентификации возбудителя при­нимают образование сероводорода, каталазы, расщепление глюкозы, лак­тозы, сахарозы, маннита.

Серологическая идентификация эризипелотриксов. Ранее вид дифференцировали на серотипы от А до О. Штаммы типа А считали ответственными за острое и сверх­острое течение эризипелоида; штаммы типа В обычно ассоциируются с хрони­ческим течением эризипелоида. Типы А и В подразделяют на подтипы, причем у здоровых свиней чаще находят G и Н, но могут быть типы А и В; у крупного рогатого скота — С и Д; у рыб — С, Д, Е. Штаммы, не имеющие типового антигена, обычно относили к типу N. В настоящее время на основании антигенных вариаций сома­тического (термостабильного) антигена Е. rhusiopathiae подразделяют на 22 серовара, причем до 80% всех изолятов составляют штаммы сероваров 1 и 2.

В повседневной лабораторной практике проводят видовую серологичес­кую идентификацию Е. rhusiopathiae в РА на стекле. С указанной целью ис­пытуемую культуру выращивают 24 часа при 37° С на плотной питательной среде. На предметное стекло наносят каплю лечебной противорожистой им­мунной сыворотки в разведении 1:50, в ней бактериологической петлей сус­пендируют выросшую бактериальную массу и учитывают результат. Серо­логическую идентификацию Е. rhusiopathiae можно проводить на различных стадиях изучения культуры при помощи прямого метода флуоресцирующих антител с применением рожистых люминесцирующих сывороток

Биопроба. Используют для выделения культуры возбудителя из исследуемого матери­ала, а также определения вирулентности выделенных культур. В первом случае из паренхиматозных органов готовят суспензию на физиологи­ческом растворе 1:10, которую вводят двум белым мышам массой 16-18 г подкожно в дозе 0,1-0,2 мл. Суточной бульонной культурой мышей зара­жают аналогичным образом и в той же дозе. Наблюдение за животными осуществляют в течение 5 суток. Гибель в положительных случаях насту­пает на 2-4 сутки, при заражении слабовирулентными штаммами — в бо­лее поздние сроки. Павших животных подвергают бактериологическому исследованию. Кроме того, рекомендуется заражать мы­шей бульонной культурой возбудителя интраперитонеально в дозе 0,1-0,4 мл. Гибель наступает на 1-4 сутки после заражения. Может быть ис­пользован для идентификации возбудителя тест пассивной защиты мышей с применением противорожистой лечебно-профилактической иммунной сы­воротки. В случае необходимости вирулентность изолята определяют на свиньях, используя для заражения метод кожной скарификации. С целью дифференциации от листерий культура может быть проверена в кератоконъюнктивальной пробе на мор­ских свинках (см. «Листериоз»).

Питательные среды. Для выделения культур лучше всего использовать питательные среды с 5-10% сыворотки крови и 0,2-0,5% глюкозы. При исследовании материала контаминированного посторонней микрофлорой, целесообразно пользовать­ся селективными средами.

Селективная среда ESB. В 1000 мл стерильного питательного бульона вносят 50 мл сыворотки крови лошади, 400 мг канамицина, 50 мг неомицина, 25 мг ванкомицина. Среда пригодна для использования в течение 12- 14 дней хранения при 4° С.

Селективная среда МВА. В 1000 мл питательного агара добавляют
0,4 г азида натрия. Стерилизуют при 121° С 15 минут и асептически вносят 50 мл сыворотки крови и 20 мл крови лошади.