Лабораторная диагностика лептоспироза

Лептоспироз — инфекционная, природно-очаговая болезнь многих видов животных и птиц, проявляющаяся лихорадкой, гемоглобинурией, желтуш­ным окрашиванием и некрозами слизистых оболочек и кожи, атонией желу­дочно-кишечного тракта, абортами, рождением нежизнеспособного потомства, снижением продуктивности животных. Возбудители лептоспироза представляют собой извитые, подвижные, грамотрицательные бактерии размером 0,1x6-12 мкм, один или оба конца которых имеют форму крюч­ка.

Лептоспиры относятся к порядку Spirochetales, семейству Leptospiraceae, роду Leptospira, который содержит два вида: L. interrogans — патогенный вид, L. biflexa — свободноживущие лептоспиры. В настоящее время на основании анализа генома в роде Leptospira выделя­ют 12 видов: L.interrogans, L.kirshneri, L.meyeri, L.noguchii, L.inadoi, L.fainei, L.borgpetersenii, L.santarosai, L.weilii, L.wolbachii, L.alexanderi, L.biflexa и 5 геномовидов, обозначаемых цифрами. По антигенной струк­туре лептоспиры подразделяют на 230 серовариантов, объединенных в 25 серогрупп.

Лабораторная диагностика лептос­пироза основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование. Для исследованияприжизненно берут кровь и мочу. Кровь для бактериологического иссле­дования берут в фазе лептоспиремии, на 1-7-е сутки болезни при наличии лихорадки. Приблизительно 5 мл крови набирают в стерильные пробирки с 0,5 мл 1%-ного натрия цитрата. Для серологических исследований кровь берут не ранее недели после клинических проявлений болезни или через 60 дней после введения вакцины.

Мочу собирают в чистую посуду (пробирки, банки и т.д.) и в кратчай­шие сроки подвергают микроскопическому исследованию, при 30-40°С в течение 3 часов, 25-30°С— 4-5 часов, 20-25°С — 6-8 часов, 16-20°С — 10-12 часов (Малахов Ю.А. с соавт., 1985). Эффективнее микроскопически исследовать мочу в первые 20-30 минут после взятия, а также нейтрализовать ее N/10 HC1 или N/10 NaOH. Если моча предназначена для получения культур возбудителя и должна быть транспортирована, то рекомендуется разводить ее 1:10 1%-ным сывороточным альбумином круп­ного рогатого скота.

Для посмертной диагностике берут трупы мелких животных, сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей. Перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спиномозговую жидкость. Если наблюдаются аборты, берут абортированный плод или желудок плода с содержимым и паренхиматозные органы.

Воду из источника для обнаружения лептоспир берут в объеме 1,5-2,0 л в стерильные колбы с ватно-марлевыми пробками.

Патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6 ч. в летнее время и 10-12 ч. при условии хранения его в охлажденном состоянии.

Таблица 49 - Основные возбудители лептоспироза у животных

(Bergey, 1984)

Таблица 50 - Лептоспиры, поражающие животных в России

Микроскопическое исследование исходного материала. В исследуемом материале лептоспиры обнаруживают в неокрашенном со­стоянии при помощи темнопольной микроскопии, реже — в окрашенных препаратах.

Темнопольная микроскопия. Для лабораторных исследова­ний применяют сухие системы с увеличением 400-500 раз. Готовят препарат «раздавленная капля». Толщина предметных стекол не должна быть больше 1-1,2 мм, покровных — 0,2 мм, в противном случае препарат не оказывается в фокусе конденсора. Стекла должны быть без царапин, чис­тые, обезжиренные. На верхнюю линзу конденсора помещают каплю дис­тиллированной воды, конденсор поднимают до уровня поверхности пред­метного столика, чтобы вода контактировала с предметным стеклом. В капле исследуют не менее 50 полей зрения.

При оптимальной настройке микроскопа лептоспиры в препарате вид­ны па темном фоне как спиралеобразные, тонкие серебристо-белые нити с Первичными завитками в виде тесно примыкающих друг к другу зерен. Концы лептоспир утолщены и оба или один загнуты, размер клеток 0,1 x 6-25 мкм. В жидкой среде лептоспиры движутся, вращаясь то в одну, то в другую сторону вокруг длинной оси, поступательно перемещаясь незагнутым концом вперед. В вязких средах движение может происходить по типу Волнового, винтового и змеевидного. В препаратах из нативного материала часто могут присутствовать клетки, потерявшие Способность к движению.

Кусочки паренхиматозных органов растирают в ступке с небольшим Количеством физиологического раствора (1:2-3), центрифугируют для осаждения крупных частиц в течение 10 минут при 3000 об/мин или отстаи­вают 1-2 часа при 4-6°С. Исследованию подвергают надосадочную жидкость. Мочу исследуют сразу после взятия и центрифугирования (10-12 тыс. об/мин, 30 минут).

Нитратную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение
5 минут, отсасывают надосадочную жидкость, повторно центрифугируют ее в течение 30 минут при 10-15 тыс. об/мин, осадок исследуют. При этом не­обходимо учитывать, что артефактные структуры, напоминающие лептос­пиры (нити фибрина, оболочки эритроцитов и др.), неподвижны.

Приготовление и микроскопия окрашенных препаратов лептоспир. Леп­тоспиры плохо воспринимают красители. Могут быть использованы следу­ющие методы окраски.

Окраска по Ромаповскому-Гимза. Мазки фиксируют спирт-эфиром (1:1) или метанолом — 3 минуты, окрашивают 8-12 часов красителями (0,5 мл краски и 10 мл нейтральной дистиллированной воды). Лептоспиры в пре­парате имеют светло-розовый цвет.

Окрашивание риванолом или аурамином по B.C. Киктенко. Используют для окраски препаратов из культур лептоспир. Тонкий ма­зок фиксируют легким нагреванием, наносят раствор 3%-ной серной кислоты и подогревают мазок в течение 1 минуты, промывают водой. На препарат наносят риванол или аурамин (1:1000), высушивают. Лептоспиры приобретают зеленоватый оттенок (риванол) или золотистый (аурамин) цвет.

Импрегнация серебром по B. Babudieri. Мазок фиксируют жид­костью Руге в течение 1-2 минут, промывают водой, наливают на препа­рат раствор танина и прогревают до появления паров, промывают в про­точной, а затем дистиллированной воде. На несколько секунд на мазок наливают раствор азотнокислого серебра, а затем заменяют раствор на свежий и подогревают до появления коричневой окраски с металлическим отливом, промывают препарат в проточной воде. При микроскопии лептоспиры имеют черный цвет на светло-коричневом фоне.

Жидкость Руге: ледяная уксусная кислота — 1 мл, формалин (40%-ный) —2 мл, дистиллированная вода —100 мл.

Раствор танина: танин — 5 г, фенол — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл.

Раствор азотнокислого серебра: к 1%-му раствору азотнокислого се­ребра в дистиллированной воде добавляют по каплям 10%-ный раствор аммиака до исчезновения первоначально выпавшего осадка и просветле­ния раствора. Раствор хранят в склянке темного стекла.

Импрегнация лептоспир серебром в гистологических срезах по Левадити. Кусочки органов (корковый слой почек, печень) толщиной 0,2-
10 мм фиксируют 24-48 часов в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина, затем переносят в 96%-ный этанол на 24 часа, выдерживают 3 часа в дистиллированной воде, трех­кратно заменяя ее на свежую.

На следующем этапе материал помещают в 1-3%-ный раствор азотно­кислого серебра на дистиллированной воде на 3-6 суток при 37° С. Мате­риал промывают в дистиллированной воде 2-5 минут, переносят на 2 ми­нуты в небольшое количество раствора редуцирующей смеси и далее в ос­новной редуцирующий раствор (пирогаллоловая кислота — 4 г, формалин чистый — 5 мл, дистиллированная вода — 100 мл) в банке темного стекла, выдерживают в растворе 24-48 часов при комнатной температуре. Реду­цирующую смесь берут из расчета 20-25 мл на кусочек ткани. Длитель­ность экспозиции контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12-16 часов.

При изготовлении срезов материал промывают в дистиллированной воде 1-2 часа. Затем последовательно обрабатывают 96%-ным этанолом 24 часа, новой порцией 96%-ного этанола 24 часа и снова 24 часа свежим спиртом. Далее материал помещают в спирт-метил (спирты этиловый и метилсалициловый поровну) до опускания кусочков на дно сосуда, затем помеща­ют на ночь в метилсалициловый спирт.

Материал переносят в парафиновую кашу (парафин и ксилол поровну) на 30 минут при 57°С, далее в парафин на 60 минут при 57°С и в свежий парафин при 57°С на 60 минут.

Парафин быстро остужают, вырезают блок с кусочком органа и на­клеивают на деревянный кубик. На сапном микротоме готовят тонкие срезы, наклеивают на предметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10-15 минут и заключают под покровное стекло в бальзам. Готовые препараты хранят в темноте.

Микроскопическая картина: лептоспиры — черные, ткань — беловато-желтая. После импрегнации серебром лептоспиры обычно имеют
S-образную с 1-2 изгибами или змеевидную форму.

Индикацию лептоспир в исследуемом материале можно проводить ме­тодом флуоресцирующих антител.

Выделение и идентификация лептоспир. Культивирование. Лептоспиры — аэробы, температурный оптимум 28-30°С, рН 7,2 - 7,6, концентрация натрия хлорида в среде — 0,05%, рост на питательных средах замедленный, первичные посевы на жидких питательных средах вы­держивают до трех месяцев. Культуры чаще вырастают через 7-20 дней, редко — через 2-3 месяца.

Первичные посевы материала обычно производят на жидкие питатель­ные среды. Для длительного хранения культур могут быть использованы полужидкие среды, с целью исследования физиологии, антигенной струк­туры — плотные среды.

Кровь высевают в количестве 3-5 капель в 5-7 пробирок с жидкой питательной средой. Посмертно посевы производят из крови сердца, ткани почек (из коркового слоя), печени, у абортированных плодов — также из содержимого желудка. Рекомендуется материал, контаминированный посто­ронней микрофлорой (моча), пропускать через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и засевать в среды, содержащие 5-флуороурацил в концентрации 200 мкг/мл. Посевы производят пастеровскими пипетками в 3-5 пробирок.

При поддержании лептоспир в лаборатории культуры пересевают пас­теровскими пипетками, причем объем исходной культуры должен состав­лять приблизительно 0,1 объема свежей среды, так как при малой посевной дозе рост бывает замедленным и скудным. Интервал пересевов культур 10-15 суток.

С целью длительного хранения без лиофилизации культуры лептоспир в пробирках заливают вазелиновым маслом, держат в темноте при комнат­ной температуре. В таких условиях лептоспиры сохраняют жизнеспособ­ность до трех месяцев.

Характер роста лептоспир на питательных средах. При размножении в жидких питательных средах лептоспиры практичес­ки не изменяют внешнего вида среды, поэтому наличие роста устанавлива­ют при помощи исследования среды из всех засеянных пробирок в препарате «раздавленная капля» методом темнопольной микроскопии через каж­дые 3-5 дней на протяжении трех месяцев.

В полужидких питательных средах рост в виде интенсивно опалесцирующего кольца обнаруживается невооруженным глазом на расстоянии 3-5 мм ниже поверхности среды. Культуры на полужидких средах выращива­ют для длительного хранения.

На плотных питательных средах (с 1% агара, 10% сыворотки кро­ви) лептоспиры образуют колонии S-, О-, R-формы. Колонии патоген­ных и сапрофитных лептоспир могут быть разнообразными: росинчатыми, круглыми диаметром 2-4 мм, кольце­видными, астровидными, с сосочковидным центром, неправильной фор­мы. Различает три фазы развития колоний: пери­од поверхностного роста, период внедрения в агар, период глубокого врастания. В конечной фазе могут формироваться крупные до 3-4 см в диаметре колонии. Колонии патогенных лептоспир вырастают на 6-20-е сутки, чаще на 7-8-й день, сапрофитные — 3-6-й день. Колонии S-формы — круглые, прозрачные, дисковидные, с тонкой периферий­ной каймой. Колонии R-формы имеют неправильную хлопьевидную конфигурацию.

Для очистки загрязненных культур рекомендуется осуществлять фильт­рацию через пластины марки «СФ» с последующим засевом фильтрата в жидких питательных средах.

Также может быть использован дробный рассев на поверхность плот­ных питательных сред в чашках Петри. Субкультуры из колоний отвивают на жидкие среды.

Свежевыделенные штаммы лептоспир можно сохранять без пересевов в течение года, если получено хорошее накопление, а культура разлита по ампулам, которые запаивают и хранят при 20° С. Культуры в пробирках, под слоем вазелинового масла, в темноте, при комнатной температуре со­храняют жизнеспособность до трех месяцев. Аналогичным образом на среде Терских удобно со­хранять лептоспиры до 5- 8 недель.

Морфология клеток лептоспир в культуре. Морфология лептоспир в культуре и исходном материале различий не имеет. Препарат из культур (помимо темнопольной микроскопии в живом состоянии) можно, в случае необходимости, окрашивать, хотя лептоспиры слабо воспринимают красители.

В колониях на плотных питательных средах через 10-14 суток куль­тивирования лептоспиры подвижны и хорошо делятся, позднее в цент­ре колонии находят густо переплетенные мертвые лептоспиры, а по пе­риферии — молодые, делящиеся.