Теоретические основы ПЦР

ПЦР применяется для молекулярно-генетического исследования образцов ткани. Метод ПЦР позволяет избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК. Используются:

1) термофильная ДНК-полимераза (Таg-полимераза);

2) специальный прибор - термальный циклизатор(амплификатор ДНК), позволяющий задавать температурный режим (90 °С, 30—50 °С, 60—-70 °С); временные параметры; количество циклов.

Процесс полностью автоматизирован. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка.

Ход работы. Для подготовки реакционной смеси необходимы:

1) исследуемая ДНК;

2) субстраты: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ;

3) два праймера;

4) термофильная ДНК-полимераза (Та^-полимераза);

5) буфер, содержащий Мg²⁺.

Из исследуемого материала (кровь, моча, гистологические срезы, околоплодные воды и др.) выделяют ДНК.

Искусственно синтезированные праймеры представляют собой олигодезоксирибонуклеотиды (20—30 нуклеотидных остатков). Для синтеза праймеров необходимо знать нуклеотидную последовательность амплифицируемой области ДНК (первичную структуру). Праймеры должны быть комплементарны 3'-концам амплифицируемого участка.

Ход работы: к 1,5 мл мочи добавляют 1 мл 20 % раствора карбоната натрия и 1 мл фосфовольфрамового реактива, перемешивают и титруют 0,01 н. раствором К₃[Fe(СN)₆] до исчезновения синего окрашивания.

Расчет: (мочевая кислота, ммоль/сут) = 0,8*А*В*0,0059/1,5

где 0,8 -- миллиграммы мочевой кислоты, соответствующие 1 мл К₃[Fe(СN)₆]; А — количество красной кровяной соли, ушедшей на титрование; В — суточный диурез, мл; 1,5 — количество взятой для анализа мочи, мл; 0,0059 — коэффициент пересчета в единицы системы СИ.

Результат: ___________________________________________________________

_____________________________________________________________________

Вывод_______________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________