Лабораторная работа № 5. Разделение белков и определение их молекулярной массы методом гель – хроматографии

Разделение белков и определение их молекулярной массы методом гель – хроматографии

Принцип метода. Разделительный гель состоит из гранул с определенным размером пор и межгранульного пространства. Молекулы, размер которых превышает размер пор гранул, движутся только в пространстве между гранулами и первыми выходят из колонки. Молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в гранулы и обратно, поэтому их вымывание (элюирование) из колонки замедляется. Чем меньше молекулярная масса вещества, тем больший объем элюирующей жидкости требуется для вымывания его из колонки.

При гель-хроматографии измеряют объем элюирования для каждого вида молекул. Чем больше объем элюирования, тем меньше молекулярная масса молекул. Молекулярную массу исследуемого вещества можно определить с помощью калибровочного графика.

Реактивы:

1) 0,9 % раствор NaCI;

2) гель сефадекса (G-200 или G-100);

3) раствор ненасыщенного голубого декстрана;

4) раствор насыщенного раствора рибофлавина;

5) 20 % раствор гемоглобина;

6) 10 % раствор NaOH;

7) 1 % раствор CuSO₄;

8) 0,5 % раствор нингидрина.

Ход работы: Колонку для разделения веществ заполняют гелем сефадекса (G-200 или G-100), полученным при гидратировании сефадекса G-200 изотоническим раствором хлористого натрия. Слой NaCI всегда должен находиться над гелем, чтобы он не высыхал. На поверхность геля наносят 2—3 капли раствора, представляющего собой смесь трех веществ: ненасыщенного раствора голубого декстрана (ММ 107), насыщенного раствора рибофлавина (ММ 3-102) и 200 г/л гемоглобина (ММ 64,6-103). Раствор для фракционирования должен сначала впитаться гелем. Затем в колонку дважды вносят по 2 мл 0,9 % раствор NaCI. После этого подключают капельницу с 0,9 % раствором NaCI, предназначенным для элюирования разделяемых веществ. При разделении смеси для гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости, т.е. открыт зажим снизу. По мере прохождения через колонку элюирующего раствора смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каждую фракцию собирают в отдельную пробирку. В соответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюируется декстран (голубой), а затем гемоглобин (красный) и рибофлавин (желтый). После элюирования смеси колонку промывают изотоническим раствором хлористого натрия до тех пор, пока гель не станет бесцветным, затем закрывают и оставляют небольшой слой раствора над гелем. Только после этого колонку можно использовать повторно.

Для выявления белка с содержимым каждой пробирки проводим биуретовую реакцию: добавляем по 6 капель NaOH и по 2 капли CuSO₄. Наблюдают за появлением окраски.

Белки и аминокислоты можно выявить и с помощью нингидриновой реакции.

Для этого в каждую фракцию (пробирку) добавляют по 1 мл нингидринового реактива и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 2 минуты. Во фракциях, содержащих белки или аминокислоты, появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Результат: ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод: ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

III.ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ