Выделение и идентификация культур иерсиний

Культивирование. Возбудители псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза являются фа­культативными анаэробами, обладающими и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Хемоорганотрофы. Оптимальная температура куль­тивирования 22-28° С, но размножаться они способны при температурах от 2 до 40° С. Диапазон рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН 7,4-7,6.

Иерсиний хорошо растут на дезоксихолатном агаре, средах Мак-Кон­ки, Эндо, Серова, СБТС. Среда Плоскирева и висмут-сульфит агар обла­дают выраженным ингибирующим действием на иерсиний обоих видов. Оба возбудителя способны расти на голодных средах (голодно-кислый агар, фосфатно-буферный раствор и др.).

Высеву исследуемого материала на питательные среды обычно предше­ствует его обогащение, позволяющее повысить эффективность выделения культур иерсиний.

Общепризнанным методом обогащения материала при исследованиях на иерсиниозы является метод холодового обогащения, основанный на спо­собности иерсиний размножаться в питательных субстратах при низких плю­совых температурах. Большинство других микроорганизмов, включая и энтеробактерии иных родов, такой способностью не обладает. Способность Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis расти на голодных средах и исполь­зование в силу этого фосфатно-буферного раствора в качестве среды обо­гащения, придают методу дополнительную эффективность.

Исследуемый материал массой не менее 20 г растирают в ступках. Из­мельченные пробы вносят в пробирки со стерильной средой обогащения (фосфатно-буферный раствор) в соотношении 1:5. Пробирки помещают в холодильник при температуре 4° С. Начиная со вторых-третьих суток хра­нения из пробирок начинают делать ежедневно (до получения положитель­ных результатов, но не более 15 суток хранения) высевы на среду Эндо или среду с индикатором бромтимоловым синим (СБТС), являющуюся диффе­ренциально-диагностической для выделения возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Существенным недостатком классического метода холодового обога­щения является его длительность (до 15 суток), из-за чего бактериологичес­кие исследования в ряде случаев затягиваются до 28 суток. Устранить этот недостаток позволяют рекомендуемые для выделения и идентификации чи­стой культуры Y. enterocolitica экспресс-методы, предусматривающие ис­пользование «холодового удара», «теплового удара» и «щелочной обра­ботки».

При применении метода «холодового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в холодильную камеру при температуре минус 18° С на 18 часов. Затем материал оттаивают и делают из него высевы на среды Эндо или СБТС.

При использовании метода «теплового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в термостат при 42° С на 18 часов. После этого про­изводят посевы на среды Эндо или СБТС.

Для метода «щелочной обработки» предварительно готовят 40%-ный раствор едкого кали на стерильной дистиллированной воде и хранят его в холодильнике. Перед проведением исследований из 40%-ного раство­ра готовят 0,5%-ный раствор едкого кали на стерильном 0,5%-ном ра­створе натрия хлорида. Для этого в стерильных условиях смешивают 7,9 мл 0,5%-ного раствора натрия хлорида с 0,1 мл 40%-ного раствора едкого кали.

Приготовленный таким образом раствор щелочи разливают по 0,2 мл в лунки полистироловой пластины и вносят в них 0,2 мл исследуемого мате­риала в среде обогащения. Смесь тщательно перемешивают. Выдержива­ют в течение 3-5 мин и делают высевы в бульон Хоттингера. Посевы инку­бируют при 37° С в течение суток и делают из них высевы в чашки со среда­ми Эндо или СБТС.

Помимо фосфатно-буферного раствора в качестве сред обогащения могут быть использованы буферно-казеиново-дрожжевая среда, 1%-ная забуферная пептонная вода, 1%-ная пептонная вода с добавлением К₂НРО₄.

Исследуемый материал с жидких сред обогащения высевают на среду Эндо или СБТС петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. Посевы инкубиру­ют при 22-25° С в течение 18-24 час (на СБТС — в течение 48 час). По истечении этого срока посевы просматривают и характерные для иерсиний колонии пересевают на слабощелочной МПА или агар Хоттингера. Посе­вы инкубируют при 22-25° С в течение суток. Из типичных изолирован­ных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Из тех же колоний делают высевы на питательный бульон для определения оксидазной активности. Посевы инкубируют при 22-25° С в течение су­ток. В бульонные культуры добавляют 0,2 мл оснафтола и 0,3 мл диметил-парафенилендиамина, содержимое пробирок перемешивают. При наличии оксидазы в течение 30 сек происходит окрашивание бульона в фиолетовый цвет. Дальнейшему изучению подлежат только грамотрицательные, не об­разующие оксидазу культуры (сем. Enterobacteriaceae). Такие культуры высевают на среду Клиглера и среду с мочевиной по Кристенсену. Для дальнейшего изучения отбирают культуры, не образующие сероводород (оранжево-красный цвет среды Клиглера не изменяется в черный после 24 час инкубирования посевов), обладающие уреазной активностью (красно-ма­линовое окрашивание среды Кристенсена в течение 1-4 суток инкубиро­вания посевов).

Характер роста иерсиний на питательных средах. На плотных питательных средах при 4-28° С оба возбудителя в аэробных условиях образуют колонии S-формы. На агаре Хоттингера и МПА через 18-24 часа образуются круглые с ровными краями, полупрозрач­ные, блестящие колонии с голубоватым оттенком, мягкой консистенцией и диаметром 0,5-1,0 мм. На агаре Эндо колонии круглые, выпуклые, блес­тящие с ровными краями, бесцветные со слегка розоватым оттенком, диа­метром от 0,1 до 1,0 мм.

На СБТС агаре через 48 часов на сине-голубом фоне среды образуются голубые колонии с фестончатым краем, выпуклым центром и суховатой матовой поверхностью, диаметром 1,5-2,0 мм. При взятии петлей они сдви­гаются по поверхности агара. Иногда (особенно у возбудителя псевдоту­беркулеза) виден светло-голубой ободок по краю колонии. Колонии дру­гих энтеробактерий, не разлагающих мочевину (эшерихии, сальмонеллы и др.), изменяют окраску среды, приобретая желтый цвет и характерную мор­фологию (сочные, выпуклые). В жидких средах (МПБ, бульон Хоттингера) образуют равномерное помутнение.

При температурах культивирования свыше 28° С микроорганизмы обо­их видов диссоциируют в R-форму. При этом на плотных питательных средах, наряду с описанными выше колониями S-формы, появляются ко­лонии с выраженным полиморфизмом по размеру, форме, цвету (особенно при температуре 37° С и выше). Чаще всего R-формы колоний имеют буг ристую поверхность, неправильную форму, неровные изрезанные края, коричнево-желтоватый цвет. Нередко они имеют суховатую консистен­цию. В жидких средах R-формы образуют помутнение и хлопьевидный осадок либо осадок и рыхлую поверхностную пленку с прозрачной надо-садочной жидкостью.

Морфология иерсиний в культуре. В мазках из культур возбудители обоих видов представляют собой грамотрицательные овоидные палочки или коккобактерии размером 0,5- 0,8x1,0-3,0 мкм. Спор и капсул не образуют. Y. enterocolitica чаще распо­лагается в мазках поодиночно, но может образовывать и цепочки различ­ной длинны. Y. pseudotuberculosis цепочки образует чаще, а также может окрашиваться биполярно.

Иерсиний обоих видов подвижны при температуре ниже 30° С (подвиж­ность выражена максимально при 20-22° С) за счет перитрихиально рас­положенных жгутиков и неподвижны при 37° С. У Y. enterocolitica подвиж­ность обычно выражена в большей степени, чем у Y. pseudotuberculosis.

Идентификация иерсиний по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для иер­синий культуральными, морфологическими и тинкториальными свойства­ми относят к роду Yersinia на основании изучения их ферментативных свойств. К иерсиниям относят штаммы микроорганизмов, не об­ладающие оксидазной активностью, не образующие сероводород, уреазопозитивные, дающие положительную реакцию с метиловым-красным, от­рицательную реакцию Фогес-Проскауэра (при 37° С), не растущие на сре­де Симмонса, не образующие лизиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, подвижные при 4-28° С и неподвижные при 37-42° С, не ферменти­рующие лактозу и ферментирующие с образованием кислоты маниит, L-арабинозу. Ни Y. pseudotuberculosis, ни Y. enterocolitica не растут в при­сутствии KCN.При дифференциации Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis следует иметь в виду, что Y. pseudotuberculosis не ферментирует лактозу, сахаро­зу, раффинозу, целлобиозу, дульцит, инозит, сорбит, инулин и D-арабинозу, но ферментируют с образованием кислоты глюкозу, галактозу,
L-арабинозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, трегалозу, маинит и салицин; редуцируют нитраты, метиловый синий; вступают в реакцию с метиловым красным; образуют каталазу; обладают уреазной активностью; не образуют ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауера при температурах 25 и 37° С.

Y. enterocolitica не ферментируют лактозу (есть лактозоположительные варианты, часто среди сероваров 05 и 07, 8), рамнозу, раффинозу; не обла­дают фенилаланиндезаминазой, лизиндекарбоксилазой и аргининдегидролазой. Реакция Фогес-Проскауэра положительная при температуре 25° С и отрицательная при 37° С.

Другие 8 видов рода Yersinia, а именно: Y. aldovae, Y. kristensenii,
Y. frederiksenii, Y. rohdei, Y. mollaretii, Y. bercovieri, Y. intermedia, Yruckeri мо­гут находиться в испражнениях людей, животных и в смывах с предметов ок­ружающей среды. Они так же, как Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis хоро­шо растут на питательных средах для выделения иерсиний. Тесты, позволяю­щие дифференцировать Y. pseudotuberculosis, 5 биоваров Y. enterocolitica от других часто встречающихся видов иерсиний, представлены в таблице 32.

Таблица 32 - Основные биохимические свойства Y.pseudotuberculosis