Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
И Y.enterocoutica, отличающие их от других видов рода Yersinia
Обозначения:«+»— признак положительный; «-» — признак отрицательный;
Возбудитель псевдотуберкулеза по ряду свойств сходен с возбудителем чумы (Y. pestis) и в ряде случаев, главным образом при исследовании материала от грызунов (особенно в природных очагах чумы), когда посевы из органов производят непосредственно на плотные питательные среды, может возникнуть необходимость дифференциации этих возбудителей. Основные отличительные признаки Y. pseudotuberculosis и Y. pestis представлены в таблице 33.
Таблица 33 - Свойства и дифференциация Y.pestis и Y.pseudotuberculosis
Наиболее ценными для дифференциации этих возбудителей являются тесты, характеризующие их отношение к мочевине, подвижность, наличие фибринолизина и плазмокоагулазы. Кроме того, следует учитывать неприхотливость к питательным средам Y.pseudotuberculosis и отсутствие полиморфизма у колоний Y.pestis, который обычно растет на специальных средах, и при 28° С на вторые сутки образует колонии только Культуры, отнесенные к видам Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis, подвергают серологической идентификации в реакции агглютинации на стекле. Завершающим этапом является определение патогенных свойств выделенных штаммов иерсиний.
Серологическая индикация и идентификация иерсиний. Y.enterocolitica имеют соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены. О-антигены возбудителя кишечного иерсиниоза являются полисахаридами, устойчивыми к нагреванию и действию этанола. Согласно классификации Winbland—Wauters по О-антигену различают более 60 сероваров Y.enterocolitica, которые обозначают арабскими цифрами 1,2 и т.д. Часть сероваров имеет разделение на субсеровары, обозначаемые буквами a, b и т.д. Также буквами обозначают и жгутиковый термолабильный антиген, разрушающийся при кипячении. Наиболее распространенными среди животных и людей являются серовары: 0l,2a,3; 02a, 2b,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 09; 010; 013,7; 014; 015; 018; 019, 8; 020; 021 и 022. Y.enterocolitica серовара О3 распространены на всех континентах. Частота их обнаружения на территории России составляет от 15 до 60% и более. Далее следуют серовары 04,32 и 05,27 (10-50%), 07,8 (5-10%) и 09 (1-30%). Другие из названных сероваров встречаются значительно реже. Часть культур типировать не удается. Y.pseudotuberculosis имеют жгутиковый антиген (Н), 2 соматических (О) антигена S и R, антигены вирулентности — V и W, расположенные в наружной мембране и выраженные при температуре культивирования иерсиний 37° С. Н-антиген образуется при температуре 18-20° С, термолабилен и не имеет диагностического значения. R-антиген является общим для всех псевдотуберкулезных бактерий, а также и для Y.pestis. Обнаружена общность этого антигена с сальмонеллами групп В и D. По Антигенные связи Y.pseudotuberculosis и большинства сероваров Оба возбудителя имеют общий антиген с энтеробактериями других видов, за счет чего могут быть получены положительные реакции с сыворотками к некоторым представителям этого семейства. У Y.pseudotuberculosis установлены антигенные связи с сальмонеллами шигеллами и эшерихиями, у Y.enterocolitica — с сальмонеллами, протеями, серрациями, гафниями, клебсиеллами. Особо следует отметить наличие антигенного родства у серовара 09 с представителями рода Brucella. В связи с этим в благополучных по бруцеллезу хозяйствах нередко выявляются неспецифические реакции с бруцеллезным диагностикумом, обусловленные инфицированием крупного рогатого скота Y.enterocolitica. Возбудитель кишечного иерсиниоза имеет антигенное родство с холерным вибрионом и возбудителем туляремии. С Y.pestis близкие антигенные связи и постоянные перекрестные положительные результаты реакций имеет возбудитель псевдотуберкулеза. Y.enterocolitica не имеет антигенных связей с Y.pestis. Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к видам Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками к наиболее распространенным сероварам иерсиний. Наборы, выпускаемые для этих целей (Санкт-Петербургский институт им. Пастера), включают сыворотку, поливалентную к I-V сероварам, и сыворотки, моновалентные к I и III сероварам Y.pseudotuberculosis, а также сыворотки к сероварам: 03; 04,32; 04,33; 05,27; 05; 06,30; 07,8; 08; 09 и 013,7 Y.enterocolitica. Реакция агглютинации ставится по общепринятой методике. С этой целью из флакона пастеровской пипеткой набирают сыворотку, не захватывая при этом осадка со дна флакона. Каплю сыворотки наносят на предметное стекло и тщательно растирают в ней петлю 20-24-часовой агаровой культуры испытуемого штамма. После получения гомогенной суспензии стекло покачивают осторожными круговыми движениями. Положительная реакция (агглютинация) наступает сразу или не позднее 2- При отрицательной реакции смесь сыворотки и бактериальной массы остается в виде равномерной гомогенной взвеси. В последние годы разработан и успешно апробирован ряд методов диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, направленных на обнаружение возбудителей или их антигенов в патологическом материале от павших животных, а также в копрофильтратах и моче больных животных с подозрением на псевдотуберкулез и иерсиниоз. Иммуноферментный анализ (ИФА). В последнее десятилетие установлена прямая зависимость между степенью выраженности вирулентных свойств Y.pseudotuberculosis и концентрацией антигенов вирулентности в наружней мембране. Показано, что для реализации адгезии возбудителя к эпителию слизистой оболочки кишечника с последующей инвазией и размножением в эпителии и макрофагах необходима экспрессия белков наружной мембраны (БНМ) — антигенов вирулентности. Данное обстоятельство делает перспективным использование БНМ с диагностическими целями. В настоящее время разработано и апробировано 3 варианта тест-систем для ИФА, направленного на обнаружение БНМ иерсиний: ИФА-ЛПС — псевдотуберкулезная система с широким спектром применения как для диагностики псевдотуберкулеза, так и для решения эпидемиологических вопросов. Чувствительность метода —105 микробных клеток в 1 см3 пробы, что соответствует 100 мкг/мл липополисахарида возбудителя. Эффективность метода 70,2-81,1%; ИФА-БНМ-1 — тест-система для ранней диагностики псевдотуберкулеза. Обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять возбудителя в органах и тканях животных, копрофильтратах и моче. Она наиболее эффективна при исследовании материала в начальный период болезни, когда антигены обнаруживают в 69-84% проб копрофиль-тратов и в 21-38% проб мочи. Чувствительность метода 10s-5х105 микробных клеток в 1 см3; ИФА-БНМ-П — тест-система для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в материалах от больных (копрофильтраты, моча), павших и вынужденно убитых животных. Для определения видовой принадлежности выявленных иерсиний (антигенов возбудителя) пробы, давшие положительную реакцию в тест-системе ИФА-БНМ-П, проверяют в тест-системе ИФА-ЛПС для выявления возбудителя (антигенов) псевдотуберкулеза. Чувствительность метода — 105 микробных клеток в 1 см3, эффективность — до 83,6% положительных проб при исследовании копрофильтратов в первые 5 дней болезни. На пике инфекционного процесса данным методом выявляют до 70% инфицированных животных. Для исследования материала в тест-системе ИФА-БНМ-П копрофильтраты, выпот брюшной полости вносят в фосфатно-буферную или буферно-казеиново-дрожжевую среду в количестве 1 г на 5 см3 среды для подращивания при температуре 3-7° С. Внутренние органы и ткани растирают с этими средами в ступке (соотношение 1:5). Образцы исследуют в первые сутки получения проб и затем на 3-5-е сутки от начала подращивания. Мочу исследуют в нативном виде. Результаты учитывают визуально или спектрофотометрически. В первом случае реакцию оценивают в крестах по интенсивности появляющегося коричневого окрашивания в лунках. Положительной считают реакцию с пробой, которая дала реакцию не менее чем на ++, и по интенсивности окраски существенно отличается от проб отрицательного контроля (К-, оцененные как «-» или «+»). Положительные результаты должны быть и в пробе с положительным контролем (К +). При спектрофотометрическом учете результатов содержимое лунок с отрицательным контрольным образцом (К-) используют в качестве нулевого контроля. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 450 нм и считают результат положительным, если коэффициент поглощения светового потока исследуемого образца достигает величины не менее 0,05. Наборы компонентов для постановки всех трех вариантов ИФА разработаны Санкт-Петербургским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Каждый из компонентов рассчитан на проведение 192 анализов, включая контроли. Реакция коагглютинации (РКА). Для постановки РКА пробы мочи и копрофильтратов (с подращиванием и без него) прогревают в водяной бане в течение 30-40 мин, центрифугируют, фильтруют и исследуют надосадочную жидкость. Сыворотку крови исследуют в нативном состоянии. На предметное стекло, разделенное на необходимое число секторов, наносят капли исследуемого материала. В каждую из капель исследуемого образца добавляют по 1 капле коагглютинирующих диагностикумов различных видов и сероваров иерсиний, в последнюю каплю вносят взвесь несенсибилизированных стафилококков (отрицательный контроль). В качестве положительного контроля на отдельном предметном стекле смешивают по 1 капле каждого использованного диагностикума с 1 каплей липо-полисахарида соответствующих бактерий в концентрации 10-20 мкг/см3. Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская слияния проб, расположенных рядом. Результат реакции учитывают через 5-30 минут экспозиции стекол во влажной камере по образованию хлопьев агглютината стафилококков и просветлению жидкости. РКА наиболее эффективна в начальный период острого заболевания (1-5-й дни), при других формах — в сроки максимальной выраженности клинических признаков. По данным различных авторов чувствительность данного метода исследований составляет 105-108 микробных клеток/см3. Эффективность при кишечном иерсиниозе —до 85%, при псевдотуберкулезе — до 60-70% в первые 5 дней от начала болезни. В отличие от РА при постановке РКА не наблюдается перекрестных реакций с другими представителями энтеробактерий, бруцеллами. Использование РКА сокращает сроки исследования на иерсиниоз с 14-17 до 3-4 суток в сравнении с традиционным бактериологическим исследованием.
Реакция латекс-агглютинации (РИА). РИА используют для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в копрофильтратах и в смывах с объектов внешней среды. В отличие от РКА, в качестве носителей иммуноглобулинов используют частицы латекса, которые не обладают антигенностью, а потому предпочтительнее стафилококка. Латексный псевдотуберкулезный диагностикум выпускается Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сывороток. Сконструированы латексные диагностикумы и для индикации Y.enterocolitica сероваров О3; О5, 30; О7,8. Чувствительность метода — 106 микробных клеток в 1 см3 исследуемой пробы. Диагноз на псевдотуберкулез данным методом может быть подтвержден у 73% больных животных. Большинство штаммов Y.enterocolitica, выделяемых на территории Российской Федерации от животных, человека и из объектов внешней среды, относятся к сероварам О3; О9; О5, 27; О8; О6, 30. В Европе преобладают бактерии сероваров О3 и О9, в США — О8, на Дальнем Востоке — О6. В многочисленных работах, посвященных изучению иерсиниозов у животных, сообщается, что практически на всех территориях от свиней изолируют Y.enterocolitica сероваров О3; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 07; 08; 09; 011;012;017 и 019,а иерсиний, выделенные от крупного рогатого скота, относятся к сероварам О3; 04; 05,27; 07,8; 012; 013 и 018.
Определение патогенности Y.pseudotuberculosis являются безусловно патогенными микроорганизмами. У них, в отличие от Y.enterocolitica, отсутствует зависимость вирулентности от наличия плазмиды, контролирующей синтез V- и W-антигенов и кальцийзависимость роста, поскольку бесплазмидные варианты сохраняют инвазивные и цитотоксические свойства. Это указывает на определяющую роль хромосомного контроля основных патогенных свойств Y.pseudotuberculosis. Поэтому выделение чистой культуры, отнесение ее к виду Y.pseudotuberculosis и определенному его серовару являются достаточными основаниями для постановки диагноза на псевдотуберкулез. Однако и в этом случае иногда прибегают к постановке биопробы. С этой целью ставят кератоконъюнктивальную пробу (тест Шереня) на морских свинках. При этом в один из конъюнктивальных мешков животного инокулируют каплю суспензии испытуемого штамма концентрацией 1010 микробных тел. При положительном результате в течение 48-72 час развивается гиперемия конъюнктивы, отек век и сужение глазной щели, наблюдают серозно-гнойное истечение. Возможно использование для постановки биопробы и белых мышей, которых заражают орально, внутривенно или внутрибрюшинно. В зависимости от метода инокуляции псевдотуберкулезного возбудителя, животные погибают на 3-9-е сутки. На вскрытии обнаруживают увеличение печени и селезенки, которые имеют многочисленные некротические очажки, напоминающие туберкулезные бугорки, но в отличие от них, не подвергающиеся обызвествлению. Аналогичные абсцессы или узелки обнаруживают и в легких. К безусловно патогенным Y.enterocolitica относятся бактерии сероваров 03; 04, 32; 05; 05, 27; 06, 30; 07,8; 08; 09 биоваров IIи IV, реже I и III.Наряду с ними выделяется и значительная часть апатогенных иерсиний. При этом принадлежность того или иного штамма к определенному серологическому и биологическому варианту далеко не всегда подтверждает либо опровергает его этиологическую значимость. Имеется достаточно сообщений о выделении патогенных штаммов иерсиний серо-биоваров, ранее считавшихся непатогенными, и наоборот. Из-за столь неоднозначной роли различных серобиоваров Y.enterocolitica в патологии животных для правильного решения вопроса о патогенности того или иного штамма, а следовательно, и для правильной постановки диагноза необходимы дополнительные исследования его факторов вирулентности. Для большинства патогенных штаммов Y. enterocolitica характерны выраженные адгезивные свойства, обусловливающие колонизацию возбудителя на энтероцитах, а также энтеротоксигенность. Продуцируемый возбудителем в больших количествах термостабильный энтеротоксин весьма сходен с таковым энтеротоксигенных неинвазивных эшерихий. Механизм действия термостабильного энтеротоксина Y.enterocolitica связан с активацией аденилатциклазы в эпителиальных клетках кишечника, что ведет к накоплению циклического гуанозинмонофосфата и нарушению водноэлектролитного баланса и энтеросорбции. В реализации действия энтеротоксина принимают участие и простоглаидины. Наблюдаемая при этом колонизация энтероцитов при минимальной инвазии или ее отсутствии подтверждает важную роль энтеротоксина в патогенезе кишечного иерсиниоза. Энтеротоксигенные Y.enterocolitica вызывают у животных и человека диареи различной интенсивности. Штаммы Y.enterocolitica, обладающие инвазивностью, способностью размножаться в органах и тканях организма хозяина, вызывают генерали зованную инфекцию. Корреляции между эптеротоксигенностью и инвазивностью у данного возбудителя не установлено. В отличие от Y.enterocolitica, у Y.pseudotuberculosis установлены максимальная инвазивность, цитотоксичиость и способность к генерализации инфекции. Действие энтеротоксина Y.pseudotuberculosis на слизистую оболочку кишечника выражено значительно меньше, чем у Y. enterocolitica. К настоящему времени установлено, что к возбудителю кишечного иерсиниоза чувствительны некоторые лабораторные животные: гибель морских свинок наблюдается при внутрибрюшном их заражении патогенными иерсиниями в дозе 3х109 микробных клеток в течение 24-48 часов. К подкожному введению возбудителя животные оказались устойчивы; у морских свинок конъюнктивит, а в ряде случаев абортивный кератит при введении патогенных иерсиний серовара 09 в конъюнктивальную полость. При этом штаммы серовара О3 патологической реакции не вызвали. Лучшими способами заражения являются внутрибрюшное и подкожное введение бактерий. При этих способах аппликации иерсиний в разных опытах и для различных сероваров (О3; 08; 09; 06,30) ЛД50 возбудителя составляли от 1,5х107 до 2,5х108 микробных клеток. При пероральном заражении мышей инфекционный процесс удавалось воспроизвести только при искусственном подавлении иммунитета (бестимусные животные, обработка иммунодепрессантами) либо на мышах-гнотобиотах. Приведенные данные свидетельствуют о том, что патогенность Y.enterocolitica для лабораторных животных изучена еще недостаточно. Дополнительную сложность в изучении данного вопроса вызывает циркуляция в природе патогенных иерсиний с различной степенью вирулентности для животных, включая и лабораторных. Вследствие этого нередко при заражении патогенными иерсиниями лабораторных животных их гибели не наблюдается, поэтому биопроба для проверки патогенности Y. enterocolitica не рекомендуется. Выше упоминалось о том, что патогенность у Y.enterocolitica детерминируется плазмидой и сопровождается наличием у таких штаммов ряда культуральных особенностей, которые предложено использовать в качестве маркеров вирулентности.
Определение способности к аутоагглютинации. Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жидкой питательной среде и заключается в спонтанном склеивании клеток иерсиний. Для проверки данной способности в две пробирки со средой Кларка засевают чистую культуру испытуемого штамма Y.enterocolitica, полученную на МПА. Посевной материал вносят в количестве 106-108 микробных клеток в объеме 1 см3. Одну из пробирок инкубируют при температуре 37° С, вторую — при 25° С в течение 24-48 часов. Патогенные иерсинии при температуре культивирования 37° С образуют обильный хлопьевидный осадок, а при 25° С — равномерное помутнение, при этом возможен небольшой, компактный осадок. Непатогенные бактерии в обеих пробирках дают рост в виде равномерного помутнения при отсутствии хлопьев. При длительном лабораторном хранении штаммов с частыми пересевами и культивированием при 37° С часть изначально патогенных клеток, составляющих популяцию изучаемого штамма, может утрачивать плазми-ду, отвечающую за вирулентность. При наличии в популяции 30-70% таких бесплазмидных клеток результаты теста становятся нечеткими. В таких случаях его повторяют после предварительного клонирования с целью выделения плазмидосодержащих клонов. Данную операцию можно осуществить при определении кальцийзависимости роста изучаемого штамма, что также относится к одному из маркеров вирулентности у данного вида бактерий. Определение кальцийзависимости роста. Данный тест основан на том, что у патогенных иерсинии при культивировании их на кальцийдефицитной агаровой среде при температуре 37° С проявляется ограничение роста. Это выражается образованием колоний значительно меньшего диаметра, чем при культивировании на обычных питательных средах или при дефиците ионов Са ++, но при температуре 25° С. Для определения кальцийзависимости готовят специальную кальцийдефицитную среду на основе коммерческого агара АГВ. На поверхность этой среды в двух чашках Петри засевают культуру испытуемого штамма, выращенную в среде Кларка при 25° С. Посев ведут с тем расчетом, чтобы получить рост изолированных колоний (от 100 до 500 клеток на стандартную чашку Петри). Одну чашку инкубируют при 37° С, вторую — при 25° С в течение 48 часов, после чего учитывают результаты теста. Патогенные иерсинии при 37° С вырастают в виде колоний значительно меньшего диаметра, чем на чашке, инкубировавшейся при 25° С. Иног да рост может отсутствовать вовсе. Дополнительное инкубирование такой чашки при 25° С в течение 24-48 часов ведет к образованию колоний обычного размера. Непатогенные иерсинии при обеих температурах образуют колонии обычной величины (через 24 часа диаметром 1,0-1,5 мм, через 48 часов — до 1,5-2,0 мм). При наличии в популяции патогенных иерсинии клеток, утративших плазмиду, детерминирующую факторы патогенности, рост при 37° С отмечают в виде различного соотношения крупных и мелких колоний.
Определение температурозависимой морфологии колоний. Морфологию колоний иерсинии изучают после их 24-48-часового инкубирования при 25° С и 37° С на агаре АГВ в чашках Петри. Учет результатов осуществляют невооруженным глазом или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют окуляр-микрометром. При 37° С патогенные иерсинии образуют малопрозрачные, желтоватого цвета, зернистые, выпуклые колонии, диаметр которых, как правило, не превышает 1,0 мм. При 25° С колонии патогенных штаммов сходны по морфологии и размерам с колониями, образуемыми непатогенными иерсиниями при обеих температурах инкубирования. Они более прозрачны, голубоватого цвета, плоские, маслянистой консистенции, имеют диаметр в 1,5- 3 раза больший, чем у патогенных иерсинии, вырастающих при 37° С.
Определение пиразинамидазной активности. Тест основан на способности непатогенных Y.enterocolitica продуцировать пиразинамидазу и отсутствии такой способности у патогенных штаммов. Для выполнения теста готовят специальную плотную питательную среду с пиразинкарбоксиамидом. В пробирку со скошенной питательной средой высевают культуру испытуемого штамма и инкубируют посевы в течение 48 часов при 25-30° С. По окончании инкубирования на поверхность среды с выросшими колониями наносят 1%-ный водный свежеприготовленный раствор железистого сульфата аммония. Учет результатов теста проводят через 15 минут. Колонии непатогенных иерсинии, продуцирующих пиразинамидазу, приобретают розовую окраску, патогенных — не изменяют своего цвета.
Серологическая идентификация вирулентных иерсинии в реакции агглютинации на стекле (РА-СВИ). Вирулентные иерсинии выявляют с помощью диагностической сыворотки к вирулентным иерсиниям (СВИ) в РА на стекле. Комплект для РА с сывороткой диагностической к вирулентным иерсиниям (СВИ) содержит СВИ с рабочим разведением 1:10 и 10 %-ную нормальную кроличью сыворотку («К-» для контроля специфичности). Для постановки реакции на обезжиренное предметное стекло наносят Положительная РА вирулентных иерсиний с СВИ характеризуется появлением крошек агглютината в течение 3 минут. Агглютинат лучше заметен на темном фоне при косом освещении. В суспензии с нормальной сывороткой («К-») агглютинат образовываться не должен. При отрицательной реакции в обеих каплях сохраняется равномерная, гомогенная суспензия бактерий.
|