Животных и из продуктов животного происхождения

Мазки фиксируют метиловым спиртом (5 мин) или этиловым спиртом (15 мин) и высушивают.

Сухие препараты помещают строго горизонтально на мостики во влаж­ной камере (чашка Петри) для предупреждения высыхания сыворотки.

Сухие сыворотки в ампулах разводят стерильным физиологическим ра­створом рН — 7,4 до указанного на этикетке первоначального объема, а затем дополнительно до рабочего разведения, указанного на этикетке ам­пулы.

На каждый мазок наносят 2 капли подготовленной таким образом сыво­ротки и распределяют ее по всей поверхности мазка. Окрашивание препа­рата осуществляют 15-20 минут при комнатной температуре или в термо­стате при 37° С. Для лучшего окрашивания препараты каждые 5-
7 минут слегка покачивают.

Препараты промывают физиологическим раствором рН — 7,4 в те­чение 5 минут, заменяя раствор за это время 4-5 раз. Отмытые препа­раты дополнительно отмывают дистиллированной водой и подсуши­вают.

После этого на мазок наносят небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и одной части 0,2 М фосфатного буфера рН — 8,0 и накрывают покровным стеклом. Для иммерсии используют не флуоресци­рующее масло или его заменитель, приготовленный из чистого диметилфталата (100 мл) и нафталина сублимированного (1,75 г) или тимола чис­того (5 г). Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом при увеличении 5x90 и силе тока 4,1 А.

Окрашенные флуоресцирующей сывороткой сальмонеллы имеют светящийся периферический контур (ободок). Это характерное свече­ние контура визуально оценивается в крестах: (++++) — сияющее зе­леновато-желтое свечение; (+++) — яркое желтовато-зеленоватое све­чение; (++) — умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свече­ние отчетливо заметного контура; (+) — слабое беловатое свечение различимого контура; (-) — клетки в виде сероватых теней, контур отсутствует или слабо заметен на отдельных участках периферии кле­ток.

Положительным результатом считается свечение типичных для сальмо­нелл форм, оцениваемое не ниже чем в два креста, при условии, что в конт­рольных препаратах, окрашенных рабочим разведением гетерологичной сыворотки, оно оценивается отрицательно. Собственное бесконтурное све­чение некоторых бактерий всегда оценивается отрицательно, хотя оно иног­да хорошо выражено.

Для проведения исследования патологического материала и мяса готовят несколько комплектов отпечатков на стекле. После фиксиро­вания один комплект отпечатков окрашивают комплексной флуорес­цирующей сальмонеллезной сывороткой и проводят флуоресцентную микроскопию.

Если сальмонеллы будут обнаружены хотя бы в одном из препаратов, устанавливают их принадлежность к той или иной группе. С этой целью окрашивают другие комплекты препаратов, используя раздельно, и преж­де всего те О-сыворотки, которые соответствуют сальмонеллам, наиболее часто выявляемым у животных данного вида

Выявление сальмонелл серогрупп В, C_1, С_2, Д, Е экспрессным методом в реакции коагглютинации. С этой целью используют набор сальмонеллезных диагностикумов се­рогрупп В, С₁, С₂, Д, Е для реакции коагглютинации.

Для постановки реакции исследуемый материал подращивают в жидкой питательной среде (селенитовый бульон, МПБ) в течение 12-18 часов при 37° С. После подращивания культуральную среду (2-3 см³) прогревают в водяной бане при 100° С в течение 30 мин, при необходимости центрифугиру­ют или фильтруют, чтобы получить прозрачный раствор. Приготовленный таким образом материал можно хранить при 4-6° С не более 7-10 суток, в замороженном состоянии — неограниченное время.

Сухие диагностикумы разводят дистиллированной водой в объеме, ука­занном на этикетке.

На предметное стекло, размеченное на сектора, наносят 6 отдельных капель исследуемой пробы, затем в первые 5 капель добавляют по 1 капле соответствующего диагностикума, а в последнюю — 1 каплю несенсиби-лизированного стафилококка (1%-ная взвесь стафилококка Cowan 1 для отрицательного контроля, который ставится с каждой пробой исследуе­мого материала). Кроме того, контролем служат: капля каждого диагно­стикума, смешанная с каплей фосфатно-солевого буфера или физиологи­ческого раствора (контроль диагностикумов на гомогенность) — на от­дельном стекле (ставится один раз в день постановки реакции); капля ди­агностикума с каплей гомологичного антигена, прилагаемого к набору (положительный контроль) — на отдельном стекле (ставится по мере не­обходимости).

Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская их слияния, стекло помещают во влажную камеру на 30 мин при комнатной темпе­ратуре.

Результат реакции коагглютинации учитывают через 30 мин при просмотре стекол над вогнутым зеркалом, регистрируя появление агтлютинации стафило­кокков.

Положительной реакцией считается появление хлопьев агглютиниро­ванных стафилококков в одной из капель с каким-либо диагностикумом при сохранении гомогенности контрольных капель и наличии положитель­ных реакций диагностикумов с гомологичными антигенами.

Интенсивность агглютинации оценивают в крестах:

«++++» — все стафилококки склеены и легко скатываются к краю кап­ли при наклоне стекла, жидкость просветлена;

«+++» — склеена большая часть стафилококков, частичное просветле­ние жидкости;

«++» — на фоне слабого просветления жидкости четко виден агглютинат; «+» —мелкие легкие хлопья, жидкость остается непросветленной;

«-» — признаков агглютинации нет, взвесь стафилококков гомоген­на, сходна с отрицательным контролем.

более 7—о хранить при 4—Положительной считают реакцию с оценкой не ниже двух крестов. Положительная реакция коагглютинации свидетельствует о наличии в исследуемом материале сальмонелл соответствующей серогруппы. При не­обходимости определения серовара сальмонелл проводят бактериологи­ческие исследования с выделением чистой культуры и ее изучением, как было указано выше. При отрицательной реакции коагглютинации даль­нейшее проведение бактериологического анализа на наличие сальмонелл серогрупп В, С₁, С₂, Д, Е считается нецелесообразным.

Идентификация сальмонелл с помощью сальмонеллезного бактерио­фага. Идентификация сальмонелл может быть осуществлена с помощью сальмо­неллезного

О-бактериофага, который высоко специфичен для этих бактерий. Он лизирует 97,5% штаммов сальмонелл и только 0,3% штаммов культур, принадлежащих к другим родам семейства кишечных. С этой целью две капли 4-или 18-часовой буль­онной культуры испытуемого штамма (можно использовать взвесь суточной агаровой культуры на физиологическом растворе) наносят тонко оттянутой пастеровской пипеткой на хорошо подсушенный МПА (рН 7,2-7,4) в чашке Петри. После подсыхания на одну из капель петлей или пастеровской пипет­кой меньшего диаметра наносят О-бактериофаг, а на другую в качестве конт­роля — каплю бульона.

Фаг наносят неразведенный или в разведении 1:5 (в зависимости от указания на этикетке). На одной чашке, таким образом, можно испытать одновременно 8-10 культур. Чашку с нанесенными культурами и О-бактериофагом помещают на 18-20 часов в термостат при 37° С, после чего учитывается результат. Положительный результат реакции при появле­нии на месте нанесения фага четко очерченной зоны сливного лизиса оце­нивают на ++++, при наличии отдельных негативных колоний, отчетли­во видимых глазом, в зависимости от их количества реакцию оценивают на +++, ++ или +.

При отрицательном результате (отсутствие лизиса) в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле.

Культура, лизировавшаяся фагом, является подозрительной на сальмонеллезную и может быть прямо с чашки испытана в РА на стекле с полива­лентной сальмонеллезной сывороткой. В случае положительного результа­та РА культуру засевают на скошенный агар и на пестрый ряд для изучения биохимических свойств и антигенной структуры (с помощью сальмонеллезных монорецепторных сывороток), без чего не представляется возможным дать окончательный ответ о принадлежности культуры к определенному сероварианту сальмонелл. Культуры, не чувствительные к О-бактериофагу, подлежат также дальнейшему изучению (биохимическому и серологическому). Большую помощь О-бактериофаг может оказать при изучении атипичных, трудно диагностируемых культур. Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к О-бактериофагу. Резистентными к нему могут быть некоторые штаммы S. derby, S. tennessee, S.anatum, S.london и некоторые другие, в то вре­мя как культуры, лишь сходные с сальмонеллезными по биохимическим свойствам (например, лактозонегативные E.coli), как правило, не лизируются этим фагом.

Серологическая диагностика сальмонеллеза. Серологическая диагностика сальмонеллеза в пробирочной реакции агглютинации

Вспомогательным тестом, результаты которого учитывают в комплексе с другими диагностическими исследованиями на сальмонеллез, может слу­жить пробирочная РА, которую ставят с сыворотками, полученными от животных, подозрительных в заболевании сальмонеллезом.

Для постановки пробирочной РА отдельными наборами выпускаются серогрупповые антигены и сыворотки трех серологических групп — В, С₁ и D_l для диагностики сальмонеллеза.

Сыворотки крови животных исследуют с различными антигенами в за­висимости от вида животного, а именно: овец — с антигеном серогруппы В и, как исключение (при соответствующих бактериологических показани­ях), с антигеном D крупного рогатого скота — с антигеном серогрупп D₁ и В; свиней — с антигеном всех трех серогрупп — В, С₁ и D₁

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1см³ в двух разведениях сы­воротки — 1:100 и 1:200. При исследовании с одним антигеном для каждой испытуемой сыворотки требуется три пробирки: в первую наливают 0,96 см³, во вторую и третью — по 0,5 см³ фенолизированного физиологического раствора. Затем в первую пробирку вносят 0,04 см³ испытуемой сыворотки, смешивают и переносят 0,5 см³ во вторую, из второй такое же количество в третью, из третьей 0,5 см³ удаляют.

После приготовления разведенной сыворотки во вторую и третью про­бирки вносят по 0,5 см³ антигена в рабочем разведении, указанном на эти­кетке, в первую — 0,5 см³ физиологического раствора. Разведение сыво­ротки в первой пробирке является контрольным.

Одновременно ставят контроль антигена с гомологичной серогрупповой (контрольной) сывороткой. Для этого сухую контрольную сыво­ротку разводят физиологическим раствором до объема, указанного на флаконе, и готовят двукратные разведения, начиная с 1:25 до предель­ного титра сыворотки. Во все пробирки, кроме первой, вносят по 0,5 см³ антигена в рабочем разведении, в первую пробирку — 0,5 см³ физиоло­гического раствора.

Для контроля антигенов на самоагглютинацию к 0,5 см³ антигена в ра­бочем разведении добавляют 0,5 см³ физиологического раствора.

Штативы с пробирками тщательно встряхивают до получения равно­мерной взвеси, помещают в термостат при 37-38° С на 4-10 часов, затем дополнительно выдерживают при комнатной температуре 14-20 часов, после чего производят учет реакции.

Реакцию считают: положительной — при оценке результатов на три-четыре креста в разве­дении сыворотки 1:200; сомнительной — при оценке три-четыре креста в разведении 1:100 или один-два креста в разведении 1:200; отрицательной — при оценке один-два креста в разведении 1:100 или полном отсутствии агглютинации.

Во всех случаях в контролях должны быть следующие показатели: положительная реакция с позитивной агглютинирующей сывороткой до ее предельного титра; отрицательные результаты в контрольных про­бирках с сывороткой без антигена и в контроле антигена с физиологи­ческим раствором.

От сомнительно реагирующих животных сыворотку крови исследуют повторно через 10-15 дней. Если нет повышения титра сальмонеллезных агглютининов, животных считают отрицательно реагирующими.

Кровекапельная реакция агглютинации (ККРА) и кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации (ККРНГА). Данные методы исследований используют для прижизненной диагнос­тики пуллороза-тифа птиц и выявления сальмонеллоносительства у птиц.

Для постановки ККРА используют цветной пуллорный антиген. От точ­ности выполнения реакции во многом зависит результат исследований. На обезжиренное предметное стекло рекомендуется наносить 1 каплю антиге­на и примешивать к нему кровь, которую берут от исследуемой птицы из гре­бешка или подкрыльцовой вены. Для оптимального соотношения антигена и крови (примерно 5:1 соответственно) последнюю лучше примешивать пла­тиновой пeтлей из проволоки толщиной 0,5-0,6 мм и внутренним диамет­ром кольца 2,5-3 мм.

Предметное стекло плавно покачивают и учитывают результат в тече­ние 1-2 мин. В положительных реакциях образуются хорошо выражен­ные синеватые хлопья агглютината, а жидкость просветляется. Если об­разуется небольшое количество мелких хлопьев, то реакцию считают со­мнительной. При отрицательной реакции агглютинат не образуется и жид­кость не просветляется.

Для постановки ККРНГА используют эритропитарный диагностикум. При этом к одной капле диагностикума добавляют одну каплю крови (т.е. соотно­шение компонентов реакции должно быть близко к 1:1). Результаты реакции учитывают через 2 мин после тщательного смешивш шя эритроцитарного ан­тигена и крови при плавном покачивании предметного стекла. Образование хорошо заметных коричневатых хлопьев свидетельствует о положительной реакции, слабовыраженных мелкозернистых хлопьев — о сомнительном ре­зультате. Отрицательная реакция характеризуется стабильной гомогенной взвесью эритроцитов в капле исследуемой крови.

Обе реакции дают лучшие результаты, если температура воздуха в по­мещении, где исследуют птицу, не ниже 16-18° С, а предметные стекла с компонентами реакции размещают на грелке-качалке М.А.Артемичева с температурой 37-42° С. При более низкой температуре и при невысоком уровне антител в крови реакцию на стекле в течение 2 мин визуально мож­но не заметить.

При необходимости реакции можно ставить пробирочным методом. Ди­агностическим титром в развернутой РНГА при исследовании сыворотки крови кур служит разведение 1:40 и выше.

Возраст цыплят, в котором удается выявить наибольшее количество но­сителей возбудителя пуллороза-тифа, 50-55 дней, индюшат — 45-50 дней. Взрослых кур исследуют в возрасте 7 мес, а индеек — в 11 мес.