Главная Случайная страница


Полезное:

Как сделать разговор полезным и приятным Как сделать объемную звезду своими руками Как сделать то, что делать не хочется? Как сделать погремушку Как сделать неотразимый комплимент Как противостоять манипуляциям мужчин? Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами Как сделать идею коммерческой Как сделать хорошую растяжку ног? Как сделать наш разум здоровым? Как сделать, чтобы люди обманывали меньше Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили? Как сделать лучше себе и другим людям Как сделать свидание интересным?

Категории:

АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника







Работа 13. Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу b-глицерофосфата (метод Боданского), УИРС





Активность щелочной фосфатазы в норме равна 0,5-1,3 ммоль/ч×л, а кислой фосфатазы – 0,06-0,13 ммоль/ч×л. Принцип определения активности фосфатаз основан на способности ферментов отщеплять неорганический фосфат от b-глицерофосфата. Для определения активности щелочной фосфатазы используют щелочной раствор b-глицерофосфата, для кислой – кислый раствор b-глицерофосфата.

Реактивы и исследуемый материал

1. Щелочной раствор b-глицерофосфата, 5 г/л, рН 8,6. 2. Кислый раствор b-глицерофосфата, 5 г/л, рН 5,0. 3. Раствор молибденовокислого аммония, 25 г/л (в 2,5 н растворе серной кислоты). 4. Раствор трихлоруксусной кислоты, 100 г/л. 5. Рабочий стандартный раствор фосфора (содержит 0,01 мг фосфора в 1 мл). 6. Раствор аскорбиновой кислоты, 10 г/л (в 0,1 н растворе HCI).

Ход работы

В центрифужную пробирку с надписью Пщ внести 1 мл щелочного раствора, в пробирку с надписью Пк - 1 мл кислого раствора b-глицерофосфата и поместить их на 5 мин в термостат при 37 °С для прогревания субстратов. Затем осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки внести по 0,1 мл сыворотки крови и полученную фермент-субстратную смесь инкубировать в течение 1 ч при 37 °С. Время термостатирования опытных проб использовать для определения содержания неорганического фосфата в контрольных пробах. Для этого в центрифужные пробирки с надписью Кщ и Кк внести соответственно по 1 мл щелочного или кислого раствора b-глицерофосфата, прилить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, после чего добавить по 0,1 мл той же сыворотки крови, пробы перемешать и через 5 мин центрифугировать в течение 10 мин при 3000 об/мин. Затем отобрать по 1,5 мл центрифугата и перенести в обычные пробирки с соответствующей маркировкой (Кщ и Кк), прибавить по 1 мл молибденового раствора, 1 мл раствора аскорбиновой кислоты, перемешать. Пробы выдерживают 10 мин при комнатной температуре, после чего их колориметрируют при красном светофильтре в кюветах шириной 5 мм. В качестве пробы сравнения используют дистиллированную воду. К опытным пробам после инкубации в термостате добавить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешать и далее обработать и колориметрировать, как контрольные пробы. Активность щелочной и кислой фосфатаз рассчитывают, используя калибровочный график. Для построения калибровочной кривой готовят следующие растворы.

Реактивы Номера пробирок
 
Рабочий раствор Рн, мл 0,6 1,2 2,4 3,6 4,8 6,0
ТХУ, мл 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Вода, мл 5,9 5,3 4,1 2,9 1,7 0,5
Перемешать
Отобрать в другие пробирки 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Молибденовый раствор, мл 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Аскорбиновая кислота 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Содержание Рн (мг) в пробах 0,001 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010

Через 10 мин после прибавления аскорбиновой кислоты пробы колориметрировать при красном светофильтре в кювете шириной 5 мм против дистиллированной воды. При построении калибровочной кривой на оси абсцисс откладывать содержание Рн в пробах, а на оси ординат – величины оптической плотности. В качестве единицы масштаба взять 10 мм на 0,001 мг фосфора.

По калибровочной кривой рассчитать число мг Рн в опытных и контрольных пробах.

Активность щелочной фосфатазы = (Пщщ)×1,47×105/31 ммоль/ч×л

Активность кислой фосфатазы = (Пкк) × 1,47×105/31 ммоль/ч×л,

где (Пщщ) или (Пкк) – количество Рн, которое освободилось при действии фосфатазы; 1,47×105 – коэффициент пересчета с 0,068 мл на 1 л сыворотки; 31 – масса 1 ммоля Рн (мг).








Date: 2015-09-27; view: 42; Нарушение авторских прав

mydocx.ru - 2015-2017 year. (0.004 sec.) - Пожаловаться на публикацию