Работа 5. Колоночная гель-фильтрация

Для гель-фильтрации используются так называемые молекулярные сита - инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Их получают на основе декстрана (сефадексы - бактериальный полисахарид), агарозы (из некоторых морских водорослей) или полимеризованных акриламидных гелей (акрилекс).

Принцип метода. Разделительный гель состоит из гранул с определенным размером пор и межгранульного пространства. Молекулы, размер которых превышает размер пор гранул, движутся только в пространстве между гранулами и первыми выходят из колонки. Молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в гранулы и обратно, поэтому их вымывание (элюирование) из колонки замедляется. Чем меньше молекулярная масса вещества, тем требуется больший объем элюирующей жидкости для вымывания его из колонки.

Реактивы, исследуемый материал

1. Раствор хлористого натрия, 8.5 г/л. 2. Гель сефадекса G-200 или 100 (или акрилексы соответствующих марок). 3. Смесь растворов: ненасыщенного раствора голубого декстрана, раствора гемоглобина 200 г/л, насыщенного раствора рибофлавина (1:1:1).

Ход работы

Колонку для разделения веществ заполнить гелем, полученным при гидратировании сефадекса G-200 изотоническим раствором хлористого натрия. Над гелем всегда должен находиться слой изотонического раствора хлористого натрия, чтобы гель не высыхал. На поверхность геля нанести 2-3 капли раствора, представляющего собой смесь трех веществ: голубого декстрана (М.М. 10⁷), рибофлавина (М.М. 3´10²) и гемоглобина (М.М. 64,6´10³). Раствор для фракционирования должен сначала впитаться гелем, затем в колонку внести 2 раза по 2 мл изотонического раствора хлористого натрия. После этого подключить капельницу с изотоническим раствором хлористого натрия, предназначенным для элюирования разделяемых веществ. При разделении смеси для гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости (т.е. открыт зажим снизу). По мере прохождения через колонку элюирующего раствора смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каждую фракцию собрать в отдельную пробирку. В соответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюируется декстран (голубой), а затем гемоглобин (красный) и рибофлавин (желтый). После элюирования смеси колонку необходимо промыть изотоническим раствором хлористого натрия до тех пор, пока гель станет бесцветным, затем закрыть и оставить небольшой слой раствора над гелем. Только в таком состоянии колонку можно использовать для работы повторно.