Получение асцитов у мышей

Гибридомы, культивируемые in vitro, секретируют от 0,1 до 10 мкг антител на 1 мл культуральной среды. Эти же гибридомы при выращивании в брюшной полости сингенных мышей могут вырабатывать от 1 до 10 мг на 1 мл асцитической жидкости. Оба метода получения моноклональных антител имеют свои преимущества и свои недостатки. Антитела, секретируемые in vitro хорошо отклонированной гибридомой, растущей в бессывороточной среде или в среде с ФСТ, лишенной иммуноглобулинов, являются в прямом смысле моноклональными и моноспецифичными. Недостатком является низкая концентрация их в культуральной жидкости. В том случае, когда требуются высокие концентрации антител, обычно выращивают гибридомы в виде асцитических опухолей, что практически всегда позволяет без сложностей получить необходимые их количества. Однако моноклональные антитела в асцитических жидкостях будут контаминированы иммуноглобулинами, присутствующими в нормальной сыворотке мышей. Поэтому для получения асцитической жидкости необходимо использовать мышей, не вступавших в контакт с антигенами, применявшимися для получения MA, a также с антигенами, которые могут перекрестно реагировать со специфическими.

Методика:

• Взрослым рожавшим самкам ВALB/C предварительно внутрибрюшинно вводят 0,5 мл пристана.

• На 7–21-й день им вводятся внутрибрюшинно 1–2×10⁶ быстрорастущих, малопассированных клонированных гибридомных клеток, предварительно отмытых бессывороточной ДМЕМ.

• Асциты развиваются на 7–14-й день. Гибридомы имеют тенденцию расти в виде твердой опухоли и продуцировать низкие уровни антител. В этом случае мышь часто погибает до образования асцитов. Для того чтобы вызвать асцит, необходимо использовать более низкую дозу гибридомных клеток и новую партию мышей.

• Асцитическую жидкость собирают в пенициллиновые флаконы, прокалывая брюшную стенку мыши стерильной иглой.

• Асцитическую жидкость центрифугируют 6–10 мин при 1000 об/мин для удаления клеток. Все жидкости, полученные от одинаковых клонов, объединяют. Хранят их замороженными при –70 °C, или при +4 °C в преципитированном состоянии.

• Осадок клеток асцитической жидкости обрабатывают 0,83%-ным раствором хлорида аммония, подогретым до 37 °C, подслаивают 1–2 мл сыворотки и центрифугируют. Надосадок отбрасывают, а осевшие клетки гибридом или криоконсервируют, или вводят внутрибрюшинно новой партии мышей (по 1–2 млн клеток на мышь) с целью получения асцитов.

Применение моноклональных антител (МКА )

1. Получение большого количества, высокоаффинных антител, специфических по отношению к антигенам гистосовместимости.

2. Получение антител к «биологическим молекулам».

3. Связывание и выделение в чистом виде антигенов микроорганизмов. МКА позволяют получать высокоочищенные препараты, свободные от вредных побочных примесей, с помощью их удается получать антигены вирусов герпеса, цитомегаловируса, бактерий и др.

4. Местная лекарственная терапия болезней внутренних органов, т.е. применение МКА в качестве доставки лекарственных средств к пораженному участку организма. Этот метод позволит лечить не только инфекционные болезни, но и раковые опухоли, которые могут разрушаться под действием лекарственных препаратов.

5. Использование МКА для диагностики, а также в анализе эмбрионального развития.