Культивирование и поддержание гибридом

В настоящее время для получения гибридом используют только такие линии миеломных клеток, которые не секретируют свои собственные иммуноглобулины. Гибридомы, полученные в результате слияния с такими вариантами, продуцируют только антитела спленоцитов. Существует много различных типов маркированных (дефектных по ГГФРТ) миеломных клеточных линий лабораторных животных (мышь, крыса) и человека. Особенностью этих линий является устойчивость к антиметаболитам (ядам) — аналогам пуриновых оснований (8-азагуанин, 6-тиогуанин и др.), которая является наследственным признаком, обусловленным генной мутацией, и связана с утратой гена ГГФРТ (табл. 19).

Таблица 2. Миеломные линии, использующиеся для получения гибридом

* Линия устойчива к 8-азагуанину.

Лимфоциты получают от животных, обычно мышей, которых иммунизируют специфическим антигеном. Смесь лимфоцитов и миеломных клеток после слияния в среде, содержащей ПЭГ, культивируют в полистироловых планшетах для тканевых культур в присутствии фидеров (фибробластов или перитонеальных макрофагов) на среде ГАТ. Через 12–17 дней гибридные клетки образуют макроскопические колонии на подстилке кормящих клеток. Супернатант каждой культуры проверяют на присутствие специфических антител. Культуры гибридом, секретирующие специфические антитела, наращивают, клонируют, замораживают и используют для изучения характеристик содержащихся в ней мАТ. Клоны гибридом, продуцирующих мАТ необходимой специфичности, вводят в брюшную полость обработанных пристаном мышей для получения асцитов. 10 мл асцитической жидкости вполне достаточно для выполнения обширных исследовательских программ, поэтому клоны гибридом не поддерживают постоянно как растущую культуру, а замораживают ивосстанавливают по мере надобности для наработки большихколичеств мАТ.

Необходимое оборудование:

• Бокс для вирусологической работы.

• Бокс для работы с культурой клеток.

• Шкаф с вертикальным ламинарным потоком воздуха.

• СО₂-инкубатор, содержание СО₂ соответствует 5–7 %.

• Центрифуги высокоскоростные.

• Люминесцентный и инвертированный микроскопы.

• Суховоздушный и жидкостный термостат.

• Низкотемпературный холодильник (температура –20...–70 °C).

• Холодильник бытовой (+4 °C).

• Сосуды для криоконсервации (СДС-20, СДС-30).

• Центрифуга настольная лабораторная 1000–8000 об/мин.

• Магнитная мешалка.

• Многоканальные пипетки на 50–250 мкл.

• Одноканальные пипетки на 2, 10, 50 и 100 мкл.

• Планшеты для культивирования клеток 4-, 6-, 12-, 24- и 96-луночные.

• Чашки Петры полистироловые.

• Гомогенизаторы стеклянные.

• Стерильная лабораторная посуда.