Клонирование гибридом

Гибридомы, как правило, не являются стабильными клеточными линиями и имеют тенденцию к потере хромосом, что часто приводит к потере антителопродукции. Клетки, потерявшие способность секретировать антитела, приобретают способность к более активному росту и могут перерастать медленно растущие клетки, сохранившие продукцию антител. Обычно уровень антител в культуральной жидкости в это время еще достаточно высок и хорошо улавливается в ELISA. Это может привести к безвозвратной потере многих полезных клонов. Для предотвращения подобных потерь предпринимают как можно более раннее клонирование гибридом, выделяя из смеси продуцирующих и непродуцирующих клеток те, которые сохранили продукцию антител. Клонирование необходимо проводить сразу же после того, как установлена специфичность секретируемых гибридомой антител к вирусу. Для получения достаточно стабильной линии гибридных клеток требуется 2-3 (иногда больше) клонирования. Для поддержания стабильности линии на достаточно высоком уровне необходимо в дальнейшем проводить клонирование не реже одного раза в три месяца при длительном пассировании в культуре, после пассирования на мышах и при больших сроках хранения клонов в криоконсервированном состоянии.

Наиболее распространенным методом клонирования является клонирование в полужидком агаре.

Методика

1. За 2–3 дня до клонирования в одном или нескольких 12-луночных планшетах готовят культуры перитонеальных макрофагов мышей. В каждую лунку пластины вносят по 0,5 мл ГС с 20 % ФСТ, содержащей 10⁴ клеток перитонеального экссудата в 1 мл.

2. За день до клонирования необходимо заменить половину среды в культуре свежей ГС с 20 % ФСТ. В день клонирования на водяной бане разогревают 3%-ный агар Дифко. Расплавленный агар охлаждают до 42 °C. Из лунок пластин с культурами макрофагов отбирают кондиционированную среду и смешивают с равным объемом свежей ГС, содержащей 20 % ФСТ и подогретой до 42 °C. По 10 мл этой смеси вносят во флаконы с расплавленным агаром. Приготовленный 0,5%-ный агар (половину) распределяют по лункам пластин. После застывания агара вносят по 9-10 капель ГС с 20 % ФСТ и в ней суспендируют 20–40 гибридных клеток того клона, который необходимо клонировать. Затем осторожными круговыми движениями пластины перемешивают среду над агаром и добавляют к ней равный объем жидкого 0,5%-ного агара из водяной бани. После повторного легкого взбалтывания ее помещают в холодильник (+4 °C) на 2-3 мин, а затем в СО₂-инкубатор.

3. Активный рост клонов в агаре начинается на 3–4-й день. Когда клоны достигают нужных размеров, их пересаживают из агара в 96-луночные планшеты с 1–2-суточными культурами макрофагов. Желательно в каждую лунку добавить по 50 мкл кондиционированной среды. Пластины с пересаженными клонами инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 2–3 дней. Затем проводят подкормку клеток, внося в каждую лунку с растущими клонами по 50 мкл свежей ГС с 20 % ФСТ. На 5–7-й день клоны тестируют на продукцию ими антител. Их наращивают и замораживают.