Культивирование клеток перевиваемой мышиной миеломы Sр2/0

Клетки мышиной миеломы Sp2/0 дефектны по ферменту ГГФРТ, что обусловливает их чувствительность к среде ГАТ и устойчивость к антиметаболиту 8-азагуанину. Иногда миеломные клетки теряют устойчивость к 8-азагуанину и приобретают способность расти и размножаться в среде ГАТ. При использовании таких реверантных клеток для гибридизации они будут расти в селективной среде, тормозить рост и маскировать наличие образовавшихся гибридом. И хотя у линии Sp2/0 очень низкий процент реверсий по сравнению с другими миеломами мышей, рекомендуется культивирование этих клеток в среде, содержащей 8-азагуанин.

Методика. Клетки миеломы культивируют при 37 °C в стеклянных матрасах на 100 или 200 мл, в среде ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной сыворотки теленка (ФСТ) и 15 мкг/мл 8-азагуанина. Посевная концентрация клеток 1–1,5×10⁵/мл. Обычно клетки растут довольно быстро и требуют субкультивирования раз в 2-3 дня. Удвоение клеточнойпопуляции происходит за 15–20 часов. Субкультивирование выполняют энергичным встряхиванием матраса (для отделенияприкрепившихся кстеклу клеток) и заменой 1/2 или 2/3 среды на свежую. Ежемесячно культуры необходимо переводить в чистые культуральныематрасы.

Для стимуляции пролиферативной активности клетки миеломы в течение недели перед слиянием необходимо субкультивировать ежедневно или раз в два дня. За 24 часа до гибридизации активно растущую культуру миеломы субкультивируют замещением половины суспензии клеток свежей гибридомной средой (ГС) с 20 % ФСТ, но без 8-азагуанина.

Кондиционированная среда

Клетки гибридом плохо растут и часто погибают при культивировании в низких концентрациях, например при субкультивировании и клонировании. Для того чтобы обеспечить их выживание в таких условиях, применяют несколько технологических приемов. Одним из примеров может быть добавление к культуре гибридом клеток селезенки мыши. В качестве фидеров (подкармливающих клеток) могут использоваться тимоциты или культуры перитонеальных макрофагов. Альтернативным способом культивирования клеток гибридом при их низкой концентрации является культивирование в кондиционированной среде, обеспечивающее выживание и рост гибридом даже в концентрациях, близких к 1 клетке в миллиметре.

Кондиционированная среда — это ДМЕМ с 20 % ФСТ, в которой росли клетки миеломы в течение 2-3 циклов деления (24–36 часов). Лучшей кондиционированной средой является среда красновато-оранжевого цвета (в начале закисления).

Методика. Клетки мышиной миеломы культивируют в среде, содержащей 8-азагуанин. Для получения кондиционированной среды трехкратно с 2-дневным интервалом заменяют всю среду с 8-азагуанином на культуре миеломных клеток свежей ДМЕМ с 10% ФСТ, но без 8-азагуанина. Для получения больших объемов кондиционированной среды клетки миеломы выращивают в стеклянных матрасах емкостью 100–200 мл. Через два дня после третьей смены среда ДМЕМ с 10 % ФСТ меняется на ДМЕМ с 20 % ФСТ. Через 24–36 часов эту среду сливают; если в ней много клеток, то ее центрифугируют; для полного удаления клеток среду фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. К культуре миеломы снова добавляют ДМЕМ с 20 % ФСТ, которая снова кондиционируется через 24–36 часов. Так как при каждой смене среды часть клеток удаляется, оставшиеся клетки продолжают активно делиться. Поэтому кондиционирование можно продолжать неограниченно долго, следя за тем, чтобы миеломные клетки были здоровыми и активно делились.

Если кондиционированная среда не требуется в течение какого-либо периода времени, клетки культивируют снова в среде с низким содержанием сыворотки (10 %). При необходимости их вновь переводят на ДМЕМ с 20 % ФСТ. Нельзя помещать культуры, используемые для получения кондиционированной среды, в среду с 8-азагуанином.

Кондиционированную среду обычно используют свежей. Допустимо хранение короткий период при комнатной температуре или при –20 °C.