Стафилококов, выделяемых от животных

Гемолизины. Гемолитическую активность исследуют посевом на кро­вяной агар. Гемолизины стафилококков отличаются биохимическими, ан­тигенными свойствами и литической активностью по отношению к эритро­цитам различных видов животных. Известны четыре типа гемолизинов ста­филококков (табл. 4).

Конкретный штамм стафилококков может синтезировать один тип ге­молизина или несколько в различных комбинациях. При тестировании ге­молитической активности у штаммов, особенно от КРС, необходимо учи­тывать наличие β-гемолизина и целесообразность дополнительного выдер­живания посевов после инкубирования также при 4-15° С.

S. aureus, S. intermedius могут синтезировать одновременно α- и β -гемолизин, что при­водит к образованию двойной зоны гемолиза: вблизи колонии — типа α, далее — β.

Таблица 4 -Спектр активности гемолизинов стафилококков

Гиалуронидаза (фактор проникновения). Обнаружение этого фермен­та у стафилококков практически наиболее легко осуществимо в тесте декапсуляции. Берут штаммы капсулообразующих видов бактерий, имею­щих в составе капсулы гиалуроновую кислоту (субстрат для гиалуронидазы): Str. equi, Раsterella multocida (серовар А). На кровяной МПА в чашке Петри крестообразно засевают штрихом Str. equi или Р. multocida (тип А) и под углом 90° аналогично в виде линии культуру испы­туемого стафилококка. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24 часов. При наличии гиалуронидазы колонии тест-микроба вблизи штриха ста­филококков образуются более мелкие и тусклые за счет разрушения кап­сулы ферментом, который диффундирует в толщу агара (результат поло­жительный).

ДНК-аза. Нуклеаза обычно выявляется у S. aureus, S. intermedius,
S. hyicus. Исследуемую культуру бактерий засевают на питательный агар с ДНК и культивируют при 37 °С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. раствор соляной кислоты. Положительный результат — при гидролизе ДНК вокруг выросшей культуры видна светлая зона.

Биопроба. Проводят для выявления патогенных свойств штаммов по летальному эф­фекту (биопроба на цыплятах), положительной дермонекротической реак­ции (некротоксин), а также на котятах для обнаружения способности про­дуцировать энтеротоксин. Известно шесть антигенноразличных энтеротоксинов (А, В, С, D, Е, F).

Дермонекротическая проба. У кролика-альбиноса массой 2-2,5 кг за сутки до опыта на боку выстригают два участка размером 2x2 см. 24-часо­вую бульонную испытуемую культуру вводят внутрикожно в дозе 0,2 мл на обоих участках. Положительный результат: через 24 часа на месте инъек­ции появляется гиперемия кожи, через 48 часов - некроз. Наблюдение про­должают 4 суток.

Биопроба на цыплятах. Проводят при изучении штаммов, выделенных от птиц. Суточную бульонную культуру в объеме 0,1 мл вводят во внешний угол глазницы двум 1-2-дневным цыплятам. Наблюдение ведут в течение 5 суток. Положительный результат: гибель цыплят на 3-5 сутки при выде­лении культуры стафилококков из паренхиматозных органов и костного мозга цыплят.

Обнаружение энтеротоксина в биопробе на котятах. Испытуемую куль­туру стафилококка засевают на среду для получения стафилококкового эн­теротоксина. Культуру стафилококка выращивают на специальной питательной среде (пептон, хлорид кальция, хлорид магния, дигидрофосфат калия, 0,8 % агар-агара, рН 7,2), в атмосфере, содержащей 20 % оксида углерода в течение трех суток. Посе­вы инкубируют в эксикаторе с 20% СО₂, что достигается смешением на дне сосуда (емк. 2000 мл) 2 г двууглекислой соды с 17 мл 10%-ный серной кисло­ты, после чего крышку эксикатора сразу закрывают. Посевы инкубируют при 37° С 3 суток, ежедневно дополняя вышеописанным способом СО₂ в эк­сикаторе. На 4 сутки содержимое колбы фильтруют через мембранные филь­тры № 3 или № 4. Приблизительно 10-15 мл фильтрата смешивают в рав­ной пропорции с теплым молоком и скармливают 4-8-недельным котятам. Положительный результат: через несколько минут котята проявляют беспо­койство, через 1-3 часа появляются симптомы гастроэнтерита: понос, рво­та. Возможен летальный исход.

В специализированных лабораториях, при наличии соответствующих реактивов, энтеротоксин выявляют серологическими методами. Испытуе­мый штамм выращивают на подходящей среде, например сердечно-мозго­вом бульоне, и супернатант исследуют.

Серологически энтеротоксин обнаруживают в РДП или при помощи иммуноферментного метода. Возможно об­наружение токсинообразования следующим способом. К расплавленному и остуженному до 45°С МПА добавляют антитоксическую стафилококко­вую сыворотку
(S. аureus) до содержания в 1 мл среды 14-15 АЕ. Агар разливают по чашкам Петри и засевают дробно изучаемую культуру для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37° С 24-48 часов. Вокруг колоний токсигенных стафилококков формируются кольца преципитации.

Фаготипирование стафилококков. Проводят для обнаружения источ­ника возбудителя и установления эпизоотологических (эпидемических) связей. Фаготиповая принадлежность является маркером, позволяющим устанавливать идентичность штаммов, даже если другие характеристи­ки подверглись изменениям. Для фаготипирования S. аureus существует международный набор фагов, включающий 21 фаготип, разделенный на 5 фагогрупп (I-V). Для типирования штаммов, выделенных от КРС, предложен свой набор фагов, состоящий из фаготипов 42 Д, 78, 102, 107, 117, 118, 119. Техника фаготипирования сводится к следующему. Исследуемую культуру выращивают на скошенном МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, пересевают в пробирку с 2,5 мл бульона Хоттингера, инкубируют при 37° С 3-4 часа, засевают газоном в чашки Петри на 1,25%-ной МПА (рН 7,2-7,4) с 0,4% глюкозы и 0,02% каль­ция хлорида. Засеянные чашки подсушивают 30-40 минут в термоста­те, расчерчивают дно чашки на необходимое количество квадратов и стандартной бактериологической петлей (d=2 мм) в каждый квадратик вносят тот или иной фаг в рабочем титре. Бактериологическую петлю после каждой манипуляции прожигают. Посевы инкубируют 5-6 часов при 37° С или 18-20 часов при 30° С. Штаммы, не лизированные набо­ром фагов, проверяют повторно, используя более концентрированный фаг (х 100). Степень лизиса оценивают по следующей схеме: «+ + + +» — полный лизис; «+ + +» — наличие в зоне лизиса колоний стафилококка; «+ +» — в зоне капли фага обнаруживают более 50 колоний фага; «+» — от 20 до 50 колоний фага;
«-» — полное отсутствие лизиса.

Штаммы стафилококков чаще лизируются несколькими фагами. В зависимо­сти от спектра фагочувствительности стафилококк относят к какой-либо одной фагогруппе, например I, II и т. д., или к смешанной группе (I и III и т.д.).