Зависимость активности RyR-канала от времени

В начале эксперимента по исследованию активности RyR-каналов все каналы в ансамбле были закрыты, а в момент времени t=0 при cis[Ca]>0 происходил быстрый процесс активации и дальнейшей процесс медленной адаптации каналов. Регистрация активности канала в численных экспериментах проводилась, после выхода на стационарный режим, начиная с момента t =3 c.

На рисунке 3.26 представлены результаты численных экспериментов по наблюдению активности RyR-канала при стационарных условиях. Данный эксперимент проводился при следующих значениях интенсивностей переходов: мс^-1, мс^-1, мс^-1, мс^-1, мс^-1. Эти значения соответствуют значению cis[Ca]=0.5 мкМ согласно формуле (2.6). Активность канала исследовалась на малых интервалах длительностью 10 мс, что позволило построить график зависимости вероятности пребывания RyR-канала в открытом состоянии от времени (рис. 3.27б).

Как видно из графика, зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии является неоднородной, и динамика RyR-канала при стационарных условиях носит стохастический характер.

Гистограмма распределения вероятности пребывания канала в открытом состоянии (рис. 3.28) имеет два локальных максимума в точках, соответствующих и . Локальный минимум соответствует значению и определяет граничное значение вероятности пребывания канала в открытом состоянии [121], которое разделяет так называемые моды активности RyR-канала на текущем интервале. При значении интервал характеризуется высокой активностью (мода Н), при канал находится в моде низкой активности L. Значение вероятности определяет нулевую активность канала (мода I). Зависимость положения канала в модах H, L и I в зависимости от времени изображена на рисунке 3.27в. Информация о положении канала в той или иной моде позволяет более детально описать его активность в текущий момент времени.

3.7.2 Зависимость активности RyR-канала от уровня cis[Ca]

На рисунке 3.29 изображены зависимости активности RyR-канала от времени при различных значениях cis[Ca] (открытое состояние соответствует значению 1).

Для сравнения результатов численных реализаций с экспериментальными данными, на рисунке 3.30 представлены графики экспериментальные регистрации активности RyR-канала при различных значениях cis[Ca] [15].

Сравнивая рисунок 3.30а с результатами моделирования (рис. 3.30б), можно сделать вывод, что результаты численных экспериментов находятся в хорошем согласии с экспериментальными данными.

В работе при проведении анализа кинетических характеристик динамики RyR-канала в рамках модели, были построены графики зависимости от концентрации Са²⁺ в cis-части при различных значениях числа кластеров в активных центрах канала, представленные на рисунке 3.31.

Зависимость активности RyR-канала при стационарных условиях от концентрации цитозольного Са²⁺ носит колоколообразный характер: растет с увеличением cis[Ca] в интервале от 0 до 100 мкМ и спадает при cis[Ca]>100 мкМ.

Эффект понижения при достаточно больших значениях cis[Ca] получил в литературе название Са²⁺-зависимой инактивации [24] и является одним из ключевых феноменов тонкой регуляции RyR-канала ионами Са²⁺. Однако следует отметить, что концентрации cis[Ca]>100 мкМ не являются физиологическими и представляют интерес только для экспериментов in vitro.

Приведенные на рисунке 3.31б графики зависимости вероятности пребывания в инактивационном состоянии () от cis[Ca] говорят о том, что с ростом cis[Ca] увеличивается частота электронных переходов в инактивационное состояние, в связи с этим повышается .

При исследовании динамических рядов активности RyR-канала при различных значениях cis[Ca] были изучены моды активности канала и построена гистограмма распределения по пребываниям в той или иной моде, представленная на рисунке 3.32.

Были введены следующие моды активности:

· Мода С/I соответствует пребыванию канала в закрытом состоянии С или в инактивационном состоянии I. На гистограмме состояния С и I разделены в третьем столбце. Вероятность пребывания в открытом состоянии в этой моде является нулевой.

· Моде H соответствуют длительные пребывания в открытом состоянии О и частые переходы из закрытого состояния в открытое (при этом время пребывания в открытом состоянии больше, чем в закрытом: ). В данной моде .

· Моде L соответствует серия кратковременных пребываний в открытом состоянии (). Закрытия происходят вследствие переходов в конформационно закрытое состояние и в инактивацинное состояние. В моде низкой активности: .

Как ясно из рисунков 3.31 и 3.32, с ростом cis[Ca] наблюдается увеличение вероятности нахождения системы в инактивационном состоянии, и оно становится превалирующим после значения cis[Ca]=100 мкМ, которое соответствует максимуму зависимости .

Согласно экспериментальным данным [20], активность RyR-каналов в кардиомиоцитах становится нулевой при очень высоких значениях концентрации цитозольного Са²⁺ (5-10 мМ), которые, предположительно, недостижимы в клетках. Однако, Са²⁺-зависимая инактивация также как и адаптация, является механизмом негативного контроля, обеспечивающим своевременное завершение процесса высвобождения Са²⁺ из СР во время клеточного цикла.

3.7.3 Влияние ионов Mg2+ на динамику одиночного RyR-канала

Ионы Mg²⁺ как и ионы Са²⁺ обладают сильным сродством с активационной частью RyR-канала, однако, занимая вакантные места на активационных частях, они не приводят к открытию канала [122, 123].

Как и в случае взаимодействия ионов Са²⁺с активными центрами, в настоящей диссертационной работе предлагается статистический подход к рассмотрению конкурентного присоединения ионов Mg²⁺ и Са²⁺ к активным центрам канала.

На рисунке 3.33а схематично представлен процесс присоединения ионов Са²⁺ и Mg²⁺ с активному центру канала. Заполнение ионами активных мест связывания активного центра описано с помощью диаграммы Эйлера (рис. 2.31б).

Было сделано предположение, что если в кластер активного центра попадают оба типа ионов, то вероятность присоединения того или иного типа ионов к свободному центру равняется ½.

Пусть – относительная концентрация ионов Mg²⁺ вблизи канала, где – максимальная концентрация магния, при которой заполнены все места связывания активного центра канала; – относительная концентрация ионов Са²⁺.

Далее определялась вероятность нахождения более чем k ионов Са²⁺ в активном центре канала с учётом присутствия на нем ионов Mg²⁺.

Относительное число активных мест, в которых находятся только ионы Са²⁺ в кластере: ; относительное число секторов, в которых находятся ионы Са и Mg, но присоединяются ионы Са: . Соответственно, относительное число «сработавших» ионов Са²⁺ равно . Число комбинаций k ионов Са²⁺ в z частях кластера равно . Наконец, вероятность обнаружения более чем k ионов Са²⁺ в кластере активной части равняется:

. (3.21)

В численных экспериментах значение cis[Ca] варьировалось в диапазоне от 0.05 до 1000 мкМ. В первой части экспериментов не учитывалось влияние ионов Mg²⁺, и интенсивность электронных переходов в зависимости от cis[Ca] рассчитывалась по формуле (см. формулу 2.10), где с – относительная концентрация ионов Са²⁺ в cis-части.

Во второй серии экспериментов учитывалось присутствие Mg²⁺ в растворе (Mg=3 мМ), и и рассчитывались согласно формуле (3.21). Графики зависимостей интенсивностей электронных переходов с учетом и без учета Mg²⁺ представлены на рисунке 3.33.

Как видно из рисунка, учет Mg²⁺ сдвигает зависимость вниз, то есть статистический подход хорошо описывает ингибирующие свойства ионов Mg²⁺.

На рисунке 3.35 представлены графики зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии от концентрации Са²⁺ в cis-части в отсутствии и в присутствии ионов Mg²⁺ .

Как видно из графика, зависимости имеют колоколообразную форму с максимумом, соответствующим значению cis[Ca]=50 мкМ (без учета Mg²⁺) и cis[Ca]=100 мкМ (с учетом Mg²⁺). Другими словами, при учете ионов Mg²⁺ происходит сдвиг вправо зависимости . Для сравнения на рисунке 3.35б приведен график из работы [20]. Анализ представленных кривых говорит о том, что результаты моделирования с высокой степенью точности совпадают с экспериментальными данными.

В присутствии ионов Mg²⁺ в растворе, в котором находится RyR-канал, график зависимости сдвигается вниз и вправо, то есть максимум достигается при больших значениях и максимум функции меньше, чем в отсутствие ионов Mg²⁺, конкурирующих с активными ионами Са²⁺.

Ионы Mg²⁺ являются потенциальными ингибиторами RyR-каналов, в связи с этим находят активное применение в фармакологии и терапии для понижения частоты высвобождений Са²⁺ для предотвращения аритмии и других патологий.

Модификация электронно-конформационной модели и введение инактивационного состояния позволили описать не только основные свойства изолированных RyR-каналов, но и важнейшие тонкие эффекты взаимодействия каналов с ионами Са²⁺, которые являются механизмами негативного контроля и должны учитываться при моделировании процесса КВВК.

Заключение

В данной главе приведены результаты параметрического анализа электронно-конформационной модели одиночного RyR-канала, сравнения результатов ЭК-модели с традиционными теориями, основанными на марковских цепях.

В рамках ЭК-модели проведена серия численных экспериментов по исследованию:

· процессов открытия RyR-канала при резком повышении уровня cis[Ca];

· процесса закрытия RyR-канала при резком уменьшении уровня cis[Ca];

· процесса адаптации RyR-канала к установившемуся уровню cis[Ca];

· зависимости вероятности пребывания RyR-канала в открытом и закрытом состояниях при постоянном уровне cis[Ca];

· влияния ионов Mg²⁺ на активность RyR-канала при стационарных условиях.

· зависимости конформационной координаты Q от времени методом Херста.

Сравнительный анализ показал, что результаты проведенных численных экспериментов хорошо согласуются с известными экспериментальными данными, и ЭК-модель дает адекватное описание стохастической динамики RyR-канала.

ГЛАВА 4. Моделирование динамики ионов Са²⁺ между отделами кардиомиоцита

В данной главе диссертационной работы описаны эффекты, связанные с кооперативной динамикой RyR-каналов в кластере высвобождающей единицы. Также представлены результаты параметрического анализа модели динамики ионов Са²⁺ между отделами клетки водителя сердечного ритма.