Особенности человека как объекта для генетических исследований. Методы изучения генетики человека: генеалогический, цитогенетический.

Особенности человека как объекта генетического исследования

1) запрет на экспериментальные скрещивания – правовые основы, морально-этические нормы. Германия – экспериментально скрещавалась чистая раса

2) большой срок жизни - медленная смена поколений (25 лет), изза этого врач может обследовать два поколения семьи. Редко 3 поколения

3) малое число детей в семье и за одну беременность: генетические законы носят статистический характер – закономерность проявляется на больших группах

5) большое число хромосом и групп сцепления – сложно выяснить – признак или ген (?????????)

6) очень большой генетический и фенотипический полиморфизм

После распространения днк диагностики было выявлено большшое колво так называемых snp (полиморфизм отдельных нуклеотидов – выявлено большое разнообразие строения днк, которое не связано с нарушением функции органов. У отдельных генов колво СНП приближается к сотне)

Клинико-генеалогический (Фрэнсис гальтон) 1869

Опубликовал книгу "Наследственный гений"

Сущность метода состоит в изучении наследовании признака среди родственников пробанда в нескольких поколениях

Пробанд - человек, обратившийся к врачу, для которого строят родословную

Порядок работы:

1) необходимо обследовать максимально большое кол-во родственников пробанда, особое внимание обращают на близких родственников (минимум 3 поколения) Обследование личное, по документам или со слов пробанда.

2) полученные данные представляют в стандартизированной форме:

- одно поколение в одной строке

- старшие поколения располагаются выше

- используют стандартные обозначения

3) анализ родословной при котором необходимо установить:

- наследственный характер

- оценить тип наследования (индивидуальный подход)

- определить круг лиц для детального обследования (гетерозиготы)

Проверка.

На первом этапе устанавливаем доминантный или рецессивный тип

Доминантный:

- признак в каждом поколении

- У больных родителей могут быть здоровые дети

- у здоровых родителей не бывает больных детей

Рецессивный:

- признак проявляется не в каждом поколении (пропуски в поколениях)

- родители могут быть здоровы при больном ребенке

- часто болеют братья и сестры

- часто родители больного являются родственниками

На втором этапе выясняем наследование аутосомное или сцеплено с полом

Если ауто - нет преимущественного поражения одного пола

Для х-сцепленного рецессивного чаще болеют мальчики;

Если болеет женщина, у нее обязательно больной отец и больны все сыновья;

Больной мужчина получает мутантный аллель только от матери и передает только дочерям

Х-сцепленный доминантный

Женщины болеют чаще;

У больного отца больны все дочери;

Больная мать передает признак половине детей независимо от пола

Голандрический тип (у), болеют только мужчины и передается только по мужской линии, проявляется во всех поколениях, у больного отца больны все сыновья.

При изменении возраста изменяется регуляция активности генов что может вызвать изменения фенотипа:

Мужчины: в пожилом возрасте может наблюдатся явление феминизации (изменяется характер отложения жира, тембр голоса)

Женщины: в пожилом возрасте может проявлятся герсутизм (растут пушковые волосы на лице)

(Хорея Геттингтона, 70+ пенентрантность 100%, 30-40 - 30%)

Цитогенетический метод:

1) определение полового хроматина в ядрах клеток некоторых тканей

- тельце Бара конденсированная х-хромосома

ОЦЕНКА:

Отсутствие тельца - одна х-хромосома

Одно тельце - две х-хромосомы

Два тельца - три х-хромосомы

2) кариотипирование

Исследуемый материал:

1. лимфоциты перефирической крови

2. клетки крастного костного мозга – из плоских костей – грудина, крыло подвздошной кости

3. фибробласты кожи

Ход работы (лимфоциты)

1. забор крови и выделение чистой фракции лимфоцитов.

2. Выделенные клетки помещают в специальную посуду в жидкую питательную среду. Например, среда 199. Среда содержит в-ва, необходимые для жизни клетки: минеральные соли и буферные системы. Культуру клеток инкубируют при Т=37 в среднем 72ч. Необходимо поддерживать стерильность и повышенный уровень СО2. К культуре клеток митогены (?) т.е вещества которые вызывают деление клеток. Например, ФГА – фитогенаглюматин. Под действием митогена клетки диференцируют, превращаются в бластные формы и начинают делиться

3. К культуре клеток добавляют колхицин, который нарушает формирование нитей веретена деления. Деление клетки тормозится на стадии метафазы.

4. Клетки разрушают с помощью гипотонического шока (клеткм добавляют дистилированную воду и они лопаются)

5. Полученный материал центрифугируют и фрагменты клеток в том числе метафазные пластинки оседают на дно пробирки

6. Остадок наносят на предметное стекло, препарат высушивают, фиксируют (сохраняют структуру объекта и прикрепляют его к носителю), окрашивают, проводят анализ кариотипа

Анализ:

Раньше для анализа метафазные пластинки врач отбирал несколько удачных полей зрения, делал микрофотографии, вручную анализировал состояние хромосом. Сегоня первичный анализ метафазной пластинки производится с помощью спец.программы. Для повышенной точности используют специальную окраску каждой пары хромосом.

40.Методы изучения генетики человека: гибридизация соматических клеток, методы изучения ДНК (рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция, электрофорез, ДНК-зонды).

Полимеразная цепная реакция

1993г – нобелевская премия. Позволяет БЫСТРО накопить большое количество копий изучаемого участка ДНК

Это позволяет увеличить чувствительностьдиагностических методов.

Увеличивает цпецифичность (точность) диагностических методов. Поэтому ПЦР может применяться на подготовительном этапе перед другми методами диагностики.

Компоненты ПЦР:

1. Образец изучаемой ДНК. ДНК из исследуемого материала можно выделить с помощью фенола и хлороформа

ДНК выделяют с помощью специального набора реактивов.

2. Термофильная ДНК-полимераза – этот фермент был выделен из бактерий, которые обитают в горячих источниках. Активность этого фермента регулируется температурой среды. Фермент работает при температуре = 60-70

3. Праймеры – короткие фрагменты ДНК, которые искуственно синтезируют. Они ограничивают с двух сторон (фланкируют) изучаемый участок ДНК

4. Нуклеотиды

5. Соли магния – без них не работает ДНК-полимераза.

Этапы проведения ПЦР

1. Выделение ДНК из исследуемого материала

2. Сборка реакционной смеси т.е. в определенную пробирку вносят все компоненты реакции. Необходимо избегать загрязнения реакции посторонеей ДНК – стерильные инструменты, перчатки, маски, оборудование

3. Проведение ПЦР. Используется специальный прибор – термоциклер. Он по заданной программе точно регулирует температуру реакционной смеси:

А) денатурация ДНК – происходит разрушение водородных связей между цепями ДНК. Т= 92-95, 10 с.

Б) отжиг праймеров – праймеры по принципу комплиментарности прикрепляются к соответствующим участкам ДНК, которые с 2 сторон ограничивают изучаемый фрагмент ДНК. Т = 30-50, 20-30с.

В) синтез ДНК. Активируется ДНК-полимераза и начиная от праймера синтезирует нужный фрагмент ДНК. Длина синтезируемого участка зависит от длительности этапа Т=60-70, 3040с.

Цикл многократно повторяется и каждый раз удваивается количество ДНК

ПЦР: Диагностика генет. Заболеваний; Диагностика паразитарных болезней; Установление родства и личности; Анализ древних останков и криминалистика

Способы детекции результатов генетического анализа

Электрофорез – проводится в специальных кюветах, которые заполняются коллоидным гелем. Специальным пробойником в геле делают лунки. В лунки помещают изучаемую днк (как …игла кащеева в яйце, яйцо в зайце, заяц в утке, утка в сундуке…) и подключают постоянный ток и определяют время. Под действием тока ДНК двигается к положительному полюсу. ДНК диссоциирует и теряет протон, поэтому приобретает отрицательный заряд. Скорость движения фрагмента ДНК зависит от массы. Чем больше масса, тем ниже скорость и фрагмент проходит меньшее расстояние. Таким образом с помощью электрофореза можно разделить фрагменты ДНК

После завершения желектрофореза препарат обрабатывают этидом бромидия. Окрашивают ДНК под действием УФ дает красное свечение.

При необходимости используют отдельные образцы ДНК с фрагментами известной массы.

ДНК-зонд – короткие искуственно синтезируемые фрагменты ДНК. Они комплиментарны к опеределенным участкам изучаемой ДНК. Например, к промотору, экзону, области мутации и т.д

Для обнаружения ДНК-зонды обрабатывают спец. Метками:

1. Радиактивные изотопы – используются редко

2. Флюорохромы – красители которые дают свечение под действием УФ

Зонд связывается по принципу комплиментарности с мишенью в молекуле ДНК (гибритизация)

В качестве примера рассмотрим медод FISH – позволяет работать с целыми биологическими объектами

1. Исследуемый материал анносят на носитель (стекло)

2. Проводят денатурацию цепи ДНК (например, с помощью щелочи)

3. Добавляют ДНК-зонды и инкубируют определенное время. За это время происходит гибритизация т.е зонд фиксируется к мишени в олекуле ДНК

4. Препарат промывают – происходит удаление незакрепленных ДНК-зондов

5. Изучение препарата в люминисцентном микроскопе. При положительной реакции обнаруживают светлые объекты

Рестрикционный анализ

Использутся специальные ферменты – рестриктазы. Каждая рестриктаза способна разрезать цепь ДНК в строго определенном месте или сайте рестрикции. Сайт рестрикции – определенный набор нуклеотидов

В настоящее время выделено очень большое количество разных рестриктаз. В качестве примера рассмотрим ТДРФ-анализ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов)

1. Профодим ПЦР для накопления изучаемого материала

2. Полученную ДНК обрабатывают рестриктазой

3. Электрофорез

4. Анализ расположения фрагментов ДНК

Серповидно-клеточная анеимя: в нормальном анализе рестриктаза обнаруживает 3 сайта рестрикции и образуется 2 фрагмента ДНК размерами 1,2 и 0,2

При мутации происходит замена А на Т и соотвественно исчезает 1 сайт рестрикции. Поэтому при действии рестриктазы образуется 1 фрагмент ДНК размерам 1,4

41.Нетрадиционное наследование признаков (цитоплазматическое наследование, геномный импринтинг). Примеры заболеваний человека с нетрадиционным наследованием.

Геномный импритинг - предположил Кроуз. В некоторых участках генома подведенных геномномту импритингу экспрессируется только один отцовский или материнский аллель

Митохондриальное наследование спермотозоиды содержат небольшое количество митохонтрий, обеспечивающих и подвижность но не передающихся потомству. Поэтому митохондрии плода имеют мариснкое происхождение. Т.е женщина передаёт свой генетичеческий материал не только через хромосомы они с митохондриальной ДНК

Наличие некоторого количества наследственного материала в цитоплазме в виде кольцевых молекул ДНК митохондрий и пластид, а также других внеядерных генетических элементов дает основание специально остановиться на их участии в формировании фенотипа в процессе индивидуального развития. Цитоплазматические гены не подчиняются менделевским закономерностям наследования, которые определяются поведением хромосом при митозе, мейозе и оплодотворении. В связи с тем что организм, образуемый вследствие оплодотворения, получает цитоплазматические структуры главным образом с яйцеклеткой, цитоплазматическое наследование признаков осуществляется по материнской линии. Как было установлено позднее, развитие этого признака обусловлено мутацией, возникающей в ДНК хлоропластов и нарушающей синтез хлорофилла в них. Размножение в клетках нормальных (зеленых) и мутантных (бесцветных) пластид и последующее случайное распределение их между дочерними клетками приводят к появлению отдельных клеток, совершенно лишенных нормальных пластид. Потомство этих клеток образует обесцвеченные участки на листьях. Фенотип потомства, таким образом, зависит от фенотипа материнского растения. У растения с зелеными листьями потомство абсолютно нормально. У растения с бесцветными листьями потомство имеет такой же фенотип. У материнского растения с пестрыми листьями потомки могут иметь все описанные фенотипы по данному признаку. При этом внешний вид потомства не зависит от признака отцовского растения.

Геномный импринтинг рассматривается как эпигенетическое явление, подчеркивая тем самым тот факт, что наследуются изменения генной активности, обусловленные различным происхождением хромосом (от отца или матери), а не структурными перестройками генетического материала. Было установлено, что в отдельных участках хромосом, которые подвержены геномному импринтингу, экспрессируется только один отцовский или один материнский аллель в отличие от обычной диаллельной экспрессии генов. Если геномному импринтингу подвержен материнский ген, то экспрессируется только отцовский аллель и наоборот. Геномный импринтинг проявляется на ранних этапах эмбрионального развития и приводит к различиям в экспрессии материнских или отцовских аллелей.

Импритинг-синдромов Прадера — ВиллиШ (умственная отсталость) и Энгельмана(глубокая умственная отсталость + судорожные движения). Митохондриальные болезни- пигментный ретинит и нейроофтальмопатия Лебера, при которой наступает двусторонняя потеря зрения(точковые мутации).