Микроскопический анализ

Для рассмотрения лекарственного сырья под микроскопом из сырья должен быть приготовлен препарат. Рассматриваемый объект помещают на предметное стекло в капле жидкости и покрывают покровным стеклом. Воздух, находящийся в растительных тканях сухого объекта лекарственного сырья, выглядит в микроскопе темным пятном и мешает рассмотрению строения препарата; поэтому он должен быть вытеснен из тканей, что достигается осторожным нагреванием препарата.

Жидкости, применяемые при изготовлении микропрепарата, имеют различное назначение и соответственно делятся на группы.

Индифферентные жидкости не реагируют с исследуемым объектом, а только служат средой для его рассмотрения. К ним относятся следующие жидкости:

Вода применяется для ориентировочного исследования. Для предотвращения образования плесени к ней прибавляют кристаллик камфоры или карболовой кислоты. По сравнению с другими жидкостями вода вызывает меньше всего изменений в препарате: форма и величина клеток и их окраска не меняются, крахмальные зерна и кристаллы щавелевокислого кальция хорошо видны; но в воде растворяется слизь, распадаются алейроновые зерна, а жирное масло стекается в более:крупные капли; непрозрачные элементы остаются темными и неясно различимыми.

Глицерин имеет перед водой то преимущество, что препараты не высыхают и могут сохраняться днями, при продолжительном воздействии глицерина ткани становятся более прозрачными, так что глицерин можно отнести к слабо просветляющим жидкостям. Обычно пользуются разведенным глицерином (1 часть глицерина + 2 части воды), прибавляя к смеси кристаллик камфоры или карболовой кислоты для предотвращения образования плесени; неразведенный глицерин сморщивает ткани, отнимая воду.

М а с л о. Для наблюдения растворимых в воде веществ употребляют масло; оно особенно пригодно для рассмотрения алейроновых зерен.

Просветляющие жидкости. Их применение имеет целью сделать препарат более прозрачным, что позволяет лучше рас смотреть детали его строения.

Лучшей просветляющей жидкостью является раствор хлоралгидрата. 3 части хлоралгидрата растворяют в 1 части воды и. после растворения прибавляют 1 часть глицерина. Действие его основано на том, что воздух из объекта вытесняется, крахмальные зерна разбухают и расплываются; жирные и эфирные масла сначала стекаются в более крупные капли, затем растворяются; белковые вещества, хлорофилл, смолы и другие включения, разрушаясь, растворяются; темноокрашенные оболочки светлеют; без изменения остаются:кристаллы. Чтобы ускорить просветление, препарат рекомендуют осторожно подогреть.

Ф е н о л. 8 частей фенола, 2 части воды и 0,5 части глицерина. Фенол растапливают, погружая склянку в теплую воду, и смешивают с глицерином и водой. Применяется и действует так же, как и хлоралгидрат, но в нем плохо видны;.кристаллы.

Едкое кали и едкий натр. Раствор КОН или NaOH в различных концентрациях (обычно от 3 до 15%). Крахмальные зерна разбухают и превращаются в клейстер быстрее, нежели от хлоралгидрата. При нагревании или продолжительном действии омыляются жиры, растворяются белковые вещества и просветляются темноокрашенные ткани.

Жидкости, вступающие в химические реакции с содержащимися в препарате веществами и помогающие таким образом установить их присутствие в рассматриваемом объекте.

Реактив на крахмал. Раствор Люголя: иода 0,5 r, иодистого калия 1 г, воды 100 мл. Иод с иодистым калием смачивают малым количеством воды; по растворении прибавляют всю воду; растирание в фарфоровой ступочке ускоряет растворение. Реактив дает сине-фиолетовое окрашивание с крахмалом; при хранении изменяется; выцветает и слабо окрашивает.

Реактивы на жирные и эфирные масла. а) Алканин. Реактив готовят или из продажного густого алканина, или из корневища растений Alcanna. 5 г крупного порошка корня настаивают в продолжение суток на 40 мл эфира, отфильтровывают, фильтрат выпаривают на водяной бане в фарфоровой чашечке. Этот остаток или 0,5 г продажного алканина растворяют при нагревании в 20 мл 80% уксусной кислоты, добавляют 50 мл 50' спирта и фильтруют. Окрашивание производят на предметном стекле; срез или порошок оставляют в алканине, закрыв покровным стеклом, на полчаса и дольше, затем алкании отсасывают фильтровальной бумагой и добавляют глицерин. 6) Судан. Анилиновой краски Судан 0,01 r, спирта 5 г, глицерина 5 г. Капли жирного и эфирного масла окрашиваются от алканина в розовый, а от судана в желто- красный цвет; так же, но несколько медленнее, окрашиваются смолы, кутикула, млечные сосуды и пробка.

Р е а к т и в ы н а с л и з ь. При наблюдении препарата в спиртоглицериновом растворе слизь представляется в виде стекловидной массы; после прибавления воды слизь разбухает и растворяется. а) Реакция с тушью. Смесь туши (1 часть) и воды (9 частей) приготовляют по мере надобности. Порошок размешивают в одной-двух каплях этой туши; на темно-сером поле зрения между неясно различаемыми частичками порошка выделяются белыми островками стекловидные бесструктурные комки слизи, которые постепенно разбухают и растекаются вследствие растворимости слизи в воде. Слегка надавливая иглой на покровное стекло, можно убедиться в эластичности и вязкости этих слизистых комков. Пузырьки воздуха могут дать повод к ошибкам; однако они окружены резким черным контуром, между тем как комки слизи матовые и края их расплывчаты. б) Метиленовая синь. В спиртовом растворе (1:5000) слизь окрашивается в голубой цвет.

Реактивы на клетчатку. а) Хлорцинк-иод. 20 г хлористого цинка растворяют в 10 мл воды; к раствору прибавляют 2 r иодистого калия и металлического иода до насыщения, т. е. столько, сколько может раствориться. Окрашивает клетчатку в фиолетовый цвет. б) Аммиачный раствор окиси меди. Темносиний реактив получается обливанием медных стружек 25% аммиаком и последующим частым помешиванием при доступе воздуха или растворением свежеосажденной окиси меди в 25% аммиаке. Хранится в темном месте, в хорошо закупоренной склянке. Клетчатка в этом реактиве медленно разбухает и затем растворяется. Кутикула остается нерастворенной.

Р е а к т и в ы н а о д р е в е с н е в ш и е к л е т к и. а) Флороглюцин с соляной кислотой окрашивает одревесневшие клетки в красный цвет. Реакцию производят в солонке или на часовом стекле; сначала срез смачивают 1% спиртовым раствором флороглюцина; через несколько минут, когда срез пропитается, прибавляют каплю крепкой дымящей соляной кислоты. Одревесневшие элементы тотчас краснеют; покраснение видно невооруженным глазом. Для быстрого удаления кислоты окрашенный препарат переносят на другое часовое стекло в густой глицерин и затем на предметное стекло в глицерин или хлоралгидрат. Если требуется более сильное просветление препарата, его предварительно подогревают с хлоралгидратом, а затем окрашивают. Если препарат окрашивается слабо или вовсе не окрашивается, то причиной этого всегда бывает соляная кислота, которая при частом открывании скляночки с реактивом или при плохой закупорке быстро теряет свою концентрацию; ее нельзя держать в склянке с пипеткой, а следует хранить в склянке с притертой пробкой, лучше всего со стеклянным колпачком, и брать стеклянной палочкой. Манипуляции с соляной кислотой следует производить подальше от микроскопа, так как пары ее портят микроскоп. При окрашивании какого-либо порошка бывает затруднительно перекладывать его из чашечек на стекло; поэтому поступают так: порошок размешивают с флороглюцином на предметном стекле, снимают бумагой излишнюю жидкость, закрывают покровным стеклом, прибавляют каплю соляной кислоты, отсасывают ее фильтровальной бумагой; с другой стороны стекла прибавляют каплю глицерина. Реактив окрашивает одревесневшие клетки в малиново-красный цвет, растворяет крахмал и отчасти кристаллы. Окраска не стойкая и скоро выцветает, особенно от воды и при нагревании. 6) Раствор сернокислого анилина. 2 г сернокислого анилина растворяют в 100 мл воды и прибавляют 5 капель серной кислоты. Окрашивает одревесневшие ткани в зеленовато-желтый цвет.

Техника приготовления микропрепарата фармацевтических материалов разнообразна. Она зависит от состояния, в котором находится сырье: цельное, резаное или порошкованное, и от принадлежности его к определенной морфологической группе — лист, кора, подземный орган.

Целью микроскопического анализа сырья является обычно установление его подлинности; поэтому, рассматривая его под микроскопом, необходимо сосредоточить все свое внимание на тех признаках, которые отличают определенный орган одного растения от того же органа другого растения. Такие признаки называются диагностическими, и микроскопический анализ сводится к их нахождению. Необходимо знать диагностические признаки каждого растительного органа и приготовлять препарат так, чтобы обеспечить наилучшую возможность их найти и рассмотреть.

Для приготовления препарата из порошкованного объекта поступают так: на предметное стекло наносят 1 — 2 капли соответствующей включающей жидкости, смачивают в ней кончик препаровальной иглы и берут ею столько порошка, сколько пристает на кончик; затем равномерно размешивают его в капле приготовленной на предметном стекле жидкости и покрывают препарат покровным стеклом, стараясь, чтобы под него не попал воздух; если жидкости под покровным стеклом окажется мало, ее добавляют, нанося пипеткой каплю жидкости рядом с покровным стеклом, под которое ее быстро затянет; если, наоборот, жидкости окажется много и она будет выходить из-под покровного стекла, ее убирают полоской фильтровальной бумаги. Жидкость выбирают в зависимости от объекта, подлежащего рассмотрению.

Если надо рассмотреть кристаллы или строение отдельных тканей, берут или просветляющую жидкость, лучше всего, раствор хлоралгидрата, или воду. Для установления строения крахмальных зерен лучше брать воду, так как в растворе хлоралгидрата они растворяются. Далее, выбирают жидкость, дающую микрохимическую реакцию на вещества, находящиеся в рассматриваемом объекте. Например, реакцию на одревесневшие ткани делают с флороглюцином и соляной кислотой; нa дубильные вещества — с раствором железоаммонийных квасцов. Иногда приходится приготовлять несколько препаратов, чтобы рассмотреть все диагностические признаки.

Можно начать ознакомление с микроскопической техникой с простейшего порошкообразного объекта: рассмотреть в 1— 2 каплях воды крахмал, зарисовать форму крахмальных зерен, их слоистость, наличие образовательного центра или трещинки, затем добавить раствор иода в иодистом калии и убедиться, что крахмал при этом синеет.

Для рассмотрения под микроскопом листья, травы и цветы, цельные или резаные, кипятят в 3 — 5 %, растворе едкой щелочи для просветления, затем переносят в небольшую чашечку и несколько раз промывают водой, пока вода не перестанет окрашиваться в бурый цвет. Продолжительность кипячения зависит от толщины листа. Предметное стекло подводят под плавающий в воде кусочек листа и вынимают его расправленным на стекле (если вытаскивать лист иголкой или пинцетом, он будет скручиваться и рваться). Скальпелем отрезают небольшой кусочек листа, остальное сбрасывают обратно в чашку. Затем приготовленный кусочек листа разрезают пополам и одну половину переворачивают на другую сторону, чтобы иметь возможность рассмотреть и верхнюю и нижнюю стороны листовой пластинки. Порошок листа рассматривают в растворе хлоралгидрата при нагревании.

Диагностическими признаками для листа будут строение эпидермиса и выросты на нем: волоски, железки и включения в основной паренхиме — кристаллы щавелевокислого кальция. В качестве характерных объектов, дающих возможность ознакомиться со всеми диагностическими признаками, можно рассмотреть листья красавки, белены, водяного перца, лан дыша, мяты, пастушьей сумки.

В аптеке плоды и семена находятся или в порошкованном, или в целом виде. Диагностическими признаками для них будут: 1) строение семенной оболочки или околоплодника,. 2) химическая природа запасных питательных веществ.

При рассмотрении порошка приготовляют несколько препаратов. Сначала устанавливают характер питательного за паса, для этого препарат приготовляют в растворе Люголя и алканина. Если в препарате в растворе Люголя будет обнаружено наличие крахмала, необходимо приготовить еще препарат в воде, чтобы выяснить строение крахмальных зерен. Для выяснения строения семенной оболочки препарат приготовляют в растворе хлоралгидрата при легком подогревании

Семенная оболочка видна в таких препаратах с поверхности; иногда она бывает разделена на отдельные слои. Наиболее характерным является механический слой, состоящий из толстостенных клеток, расположенных или вертикально к поверхности семени и образующих полисадную ткань, или вытянутых вдоль поверхности семян. В случае цельных плодов и семян микроскопического исследования обычно не требуется: их подлинность можно установить по внешнему виду. Лишь изредка, в сомнительных случаях, прибегают к микроскопии

Для приготовления препаратов оболочки семена кипятят. 1 — 2 минуты в растворе едкой щелочи. После этого семенная оболочка легко расслаивается иглой на предметном стекле на отдельные слои. Их помещают в водный глицерин и рассматривают.

Срезы с плодов или семян делают после предварительного: увлажнения, которое достигается или выдерживанием в течение суток во влажной камере, или при более грубых объектах замачиванием в течение нескольких дней в водном глицерине. Мелкие, но плоские семена трудно удержать в руке при изготовлении срезов, и их удерживают при помощи пробки. Пробку кипятят и распаривают, затем надрезают скальпелем и, поместив в разрез семена, делают срез бритвой. Круглые семена в пробке не удержать; поэтому их помещают в парафин. Берут кусочек парафина и втыкают в него нагретый на пламени горелки кончик иглы; парафин расплавляется, в него вносят семя, а когда парафин застынет делают срезы бритвой через объект вместе с парафином. Затем срезы помещают и предметное стекло и рассматривают в растворе хлоралгидрата. Для ознакомления с техникой работы можно взять семена горчицы или льна.

Коры могут быть порошкованные, резаные и цельные. Важной в диагностическом отношении в корах будет механическая ткань. Она представлена одревесневшими волокнами и каменистыми клетками. Волокна могут быть узкие и длинные или более толстые и короткие. Иногда они лежат пучками, причем могут сопровождаться кристаллической обкладкой; иногда разбросаны в основной ткани коры поодиночке или небольшими группами по 2 — 3 волокна. Каменистые клетки:. тоже могут быть расположены одиночно или группами, „гнездами".

Для рассмотрения под микроскопом механические элементы окрашивают, обрабатывая порошок, соскоб или срез раствором флороглюцина и дымящей соляной кислотой. После обработки жидкость должна быть тщательно убрана полоской фильтровальной бумаги и объект заключен в раствор хлоралгидрата: Можно сделать реакцию на одревеснение и с раствором сернокислого анилина. По мере надобности готовят также препараты с едкой щелочью или железоаммонийными квасцами.. В первом случае покраснение докажет присутствие антрагликозидов, во втором — черно-синее или черно-зеленое окрашивание говорит о наличии дубильных веществ.

Резаные коры рассматривают так: соскоблив часть коры скальпелем, ее помещают в раствор хлоралгидрата, или мелкие кусочки коры кипятят 3 — 5 минут в 5% растворе едкой щелочи, раздавливают их на предметном стекле и заключают ' в раствор глицерина. Цельные коры предварительно замачивают в водном глицерине или, разломив на куски длиной 1 — 2 см и шириной около 0,5 — 1 см, кипятят их с водой 1 — 3 минуты. Размягченные куски коры подравнивают скальпелем, чтобы получить правильное поперечное и продольное сечение, и делают срезы. Срезы помещают во флороглюцин с крепкой соляной кислотой, а затем перекладывают их в раствор хлоралгидрата или окрашивают одревесневшие ткани сернокислым анилином. Характерные элементы можно рассмотреть в коре калины или дуба.

Корни и корневища тоже могут быть порошкованные резаные или цельные. Важным в диагностическом отношении в данном случае является строение проводящих пучков и характер питательного запаса. Большинство подземных органов содержит крахмал; в этом случае характерным будет строение крахмальных зерен; корни сложноцветных часто, содержат вместо крахмала инулин, а некоторые корни, например сенега, жирное масло. В сосудистопроводящих пучках; наиболее интересно строение сосудов: ситовидные трубки в сухих объектах плохо различимы и диагностического значения не имеют. Механические элементы, как и в корах, бывают в виде волокон и каменистых клеток.

Порошок корней и корневищ рассматривают на нескольких препаратах: в растворе Люголя для обнаружения крахмала, в случае его наличия, в воде — для установления строения порошка. Для обнаружения жирного масла препарат рассматривают в растворе судана или алканина.

Сосуды и механические ткани препарата рассматривают в растворе хлоралгидрата.

Цельные корни и корневища обычно не требуют анатомического исследования для определения подлинности. В сомни тельных случаях с них делают поперечный и продольный срезы после предварительного замачивания в разбавленном глицерине в течение 1 — 3 суток. Обработка срезов такая же, как и для кор.