Ионообменная и ионная ВЭЖХ

Ионообменная хроматография используется для анализа как органических (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неорганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компонентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными группами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиониты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионообменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами —(СН₂)₃N⁺Х^– используются для разделения анионов, а сорбенты с группами —(СН₂)SО₃^–Н⁺ – для разделения катионов. Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разделения катионов – модифицированные силикагели.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные растворы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органических растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография — вариант ионообменной хроматографии, в котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества используется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного определения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них основан на подавлении электропроводности электролита ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между аналитической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализация ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деионизированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами, обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки времени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действующим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно обновляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении, противоположном направлению потока ПФ.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хроматография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропроводностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органические кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ВЭЖХ

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант ВЭЖХ, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах молекул и частично на их форме и полярности. Для разделения используют пористые сорбенты – полимеры, силикагель, пористые стекла и полисахариды. Размер частиц сорбентов 5–10 мкм.

Преимуществами пористых стекол и силикагеля являются быстрая диффузия ПФ и молекул анализируемого вещества в поры, устойчивость в различных условиях (даже при высоких температурах). Полимерные сорбенты представляют собой сополимеры стирола и дивинилбензола (это гидрофобные сорбенты, используемые с неполярными подвижными фазами) и гидрофильные гели, получаемые из сульфированного дивинилбензола или полиакриламидных смол.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы, размер которых больше среднего диаметра пор, вообще не проникают в сорбент и элюируются вместе с подвижной фазой первыми. Молекулы с диаметром значительно меньше размера пор сорбента свободно проникают в него, остаются в неподвижной фазе наибольшее время и элюируются последними. Молекулы средних размеров проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. Они элюируются с различными временами удерживания между самыми крупными и самыми мелкими молекулами. Разделение компонентов хроматографируемого образца происходит в результате повторяющихся актов диффузии компонентов образца в поры сорбента, и обратно.

В эксклюзионной хроматографии для характеристики удерживания используется объем удерживания, равный произведению скорости потока ПФ на время удерживания.

Подвижная фаза. Выбор ПФ зависит от типа сорбента. Эксклюзионная хроматография в целом делится на гель-фильтрационную и гель-проникающую хроматографию.

Метод гель-фильтрационной хроматографии используют для разделения водорастворимых соединений на гидрофильных сорбентах. Подвижные фазы представляют собой водные буферные растворы с заданным значением рН.

В гель-проникающей хроматографии применяются гидрофобные сорбенты и неполярные органические растворители (толуол, дихлорметан, тетрагидрофуран). Этот метод используют для анализа соединений, малорастворимых в воде.

Детекторы. В качестве детекторов в эксклюзионной хроматографии используются дифференциальные рефрактометрические детекторы, а также спектрофотометрические детекторы (в том числе, в ИК-области спектра). Применяются также вискозиметрический и проточный лазерный детекторы. Эти детекторы в комбинации с рефрактометром или другим концентрационным детектором позволяют непрерывно определять молекулярную массу полимера в ПФ.