Модификация радиочувтвительности. Кислородный эффект

В начале 50-х годов появились сообще­ния о реальной возможности ослабле­ния летального эффекта облучения жи­вотных путем предварительного (перед облучением) введения в организм неко­торых химических соединений. Они по­лучили название протекторов (от лат. protector — защитник, покровитель), а сам процесс ослабления поражения назвали химической защитой. Рассмотрим принципиальную возможность искусственного повышения радиоустойчивости клетки и организма.

Не менее активно разрабатывается и альтернативная сторона проблемы, возникшая несколько позднее, — поиск средств, усиливающих лучевое поражение. В этом, прежде всего, заинтересована радиационная онкология, так как радиорезистентность многих опухолей не позволяет подвергнуть их облучению в нужной степени из-за опасности необратимого повреждения нормальных тканей. Такие средства, снижающие радиорезистенгность, были найдены. Они получили название сенсибилизаторов. Разработка путей сенсибилизации идет параллельно с получением новых сведений о механизмах лучевого поражения клетки: используют, например средства, усиливающие первичное поражение ДНК, ингибиторы восстановления, агенты, синхронизирующие клетки на наиболее радиочувствительной стадии клеточного цикла или, напротив, избирательно повреждающие клетки на радиорезистентных стадиях,

Говоря о модификации лучевого поражения, обычно используют два ставших традиционными альтернативных понятия — защита и сенсибилизация, имея в виду, что как защитные, так и сенсибилизирующие агенты применяются, а, следовательно, и действуют только перед и во время облучения при обязательном условии, что сами они не влияют на жизнеспособность модифицируемого объекта. Накопленный опыт показал, однако, что, во всяком случае, в интересах прикладной радиобиологии, целесообразно заменить термины радиосенсибилизация и защита на более общие понятия — соответственно усиление и ослабление лучевого поражения, приняв, что и то и другое может быть достигнуто независимо от времени использования (до или после облучения) модифицирующего агента.

Рис. III.20. Оценка усиления действия радиации (объяснение см. в тексте):

1 — агент, 2 — радиация

В принципе возможны три результата комбинированного воздействия двух (или нескольких) агентов (рис. III.20):

1. аддитивность, когда результат совместного действия равен сумме эффектов каждого из агентов, независимо от последовательности их применения;
2. синергизм, когда результат совместного их применения превосходит эффект, ожидаемый от аддитивного действия;
3. потенцирование, когда действие одних агентов, как и при синергизме, усиливается другими, которые сами по себе (в отли­чие от синергизма) наблюдаемого эффекта не вызывают. (Эти определения справедливы только в случае линейной зависимости вызываемых эффектов от дозы каждого из агентов (рис. III.20). Несколько более сложным является определение понятия синергизма при нелинейности этих зависи­мостей.)

Таким образом, в классической интерпретации радиосенсибилизация, являясь разновидностью эффекта потенцирования, представляет собой лишь частный случай усиления радиочувствительности.

Все сказанное относится и к проблеме противолучевой защиты. Здесь также, во-первых, уже самой жизнью выделены так называемые средства ранней терапии, эффективные при применении непосредст­венно или в ближайшее время после облучения. К ним относятся, на­пример, препараты ДНК, гемотрансплантаты, полисахаридные комп­лексы и др. Во-вторых, сейчас уже ясно, что нельзя сводить механизм противолучевой защиты протекторами только к ослаблению первич­ных актов поражения. Учитывая многоэтапный процесс развития по­следнего, имеется возможность влиять на каждый из его этапов. Более того, в последнее время становится все более популярной точка зрения о том, что действие всех радиозащитных агентов реализуется только через ранние репаративные процессы, и лишь скоротечность последних не позволяет или, точнее, затрудняет регистрацию эффекта при применении защитных агентов в процессе или после облучения (Л. X. Эйдус, Ю. Н. Корыстов, 1984).

Для оценки радиомодифицирующего эффекта, вне зависимости от избранного показателя поражения, могут быть использованы три критерия.

Абсолютная величина разности между показателями в опыте (облучение с используемым модифицируемым агентом) и в контроле (само по себе облучение в той же дозе);

Индекс эффекта - отношение показателей в опытной и контрольной группах.

Фактор изменения дозы (ФИД) - отношение равно эффективных доз в опыте и контроле; как при усилении, так и при ослаблении лучевого эффекта берется отношение большей дозы к меньшей.

Рис. III.21. Влияние протекторов на

гибель мышей, облученных в до­зах 7—12 Гр;

1 - контроль, 2 - цистафос, 3- АЭТ, 4 – мексамин, 5 - АЭТ+мексамин;

ФИД, вычисленный для доз, вызываю­щих 50%-ную гибель мышей, равен 1,5; 1,55; 1,53 и 1,83 соответственно

Рис. III.22. Кривые выживания клеток лейкемии Р-388, облученных в орга­низме мышей через 4 дня после че­тырех ежедневных внутрибрюшинных инъекций 5-йоддезоксиуридина (по Р. Берри, 1965):

1 - без ЙДУР, 2- 100 (мг/кг)x4, 3 -300 (мг/кг)x4, 4 - 500 (мг/кг)x4; ФИД, вычисленный по 10%-ной выживаемости (в порядке возрастания концентрации сен­сибилизатора), составляет 1,3; 1,4 и 2,2

Кроме химических модифицирующих агентов с давних пор извест­но о сильном влиянии на исход лучевого поражения кислорода.

В 1909 г. Г. Шварцем было замечено, что на гиперемированной коже облу­ченных больных остается менее пигментированная область, повторяющая форму тубуса рентгеновской трубки. Как потом стало ясно, причиной этого явления было несовершенство аппаратной техники того времени. Вследствие малой мощ­ности трубки облучение производили на минимальном расстоянии от тела и часто пережимали тубусом питающие кожу сосуды, что приводило к временной ло­кальной ишемизации, а, следовательно, к снижению концентрации кислорода, от которой, как выяснилось позднее, в значительной степени зависит радиочувствительность.

Под кислородным эффектом (КЭ) обычно понимают явление уси­ления лучевого поражения при повышении концентрации кис­лорода по сравнению с наблюдаемым в результате облучения в анаэробных условиях.

Рис. III.23. Кривые выживания клеток тайского хомячка, подвергнутых ре невскому облучению:

1 — в воздухе, 2 — в азоте; дозы. вызывающие одинаковую выживаемость в азоте и воздухе, составляют 30 и 10 Гр соответственно; ККУ=3

КЭ - универсальное явление в радиобиологии. Он обнаружен по различным показателям лучевого поражения, как в модельных системах, так и в экспериментах на всех уровнях биологической организации. Тем не менее, еще по сей день, нет полной ясности в том, какие свойства, присущие кислороду, ответственны за его радиомодифицирующее действие.

В макромолекулах при их ионизации возникают скрытые повреждения, которые в отсутствие кислорода сами по себе еще не ведут к потере активности, однако, будучи фиксированы кислородом, переходят в явные повреждения.

Время существования таких кислородозависимых потенциальных повреждений в принципе может быть весьма большим. Так, еще в 50-х годах Л.Х. Эйдус показал, что в молекулах белков такие повреждения сохраняются в течение десятков минут и часов. Столь длительное последствие, однако, не обнаруживалось в опытах с нуклеиновыми кислотами. Наличие в живой клетке SH-соединений, немедленно взаимодействующих с потенциальными повреждениями, практически исключает возможность определения истинной продолжительности последних.

Количественным выражением изменения эффекта облучения под влиянием кислорода служит ФИД, который в этом случае называют коэффициентом кислородного усиления - ККУ (OER —oxygen enhancement ratio).

Для примера на рис. III.23 приведены данные об изменении эффективности воздействия излучения в 3 раза за счет КЭ.

Участие кислорода в реализации возникающих под влиянием образования потенциальных повреждений в клетках происходит в момент восстановления. Наиболее четко это продемонстрировано (1958) в изящных экспериментах с использованием метода сверхбыстрого смешивания и импульсного облучения. Предварительно было установлено, что добавление кислорода к бактериям, находящимся в условиях аноксии, за 20 мс до облучения обеспечивало полную оксигенацию, и, соответственно, усиливало их поражение. Доставка же кислорода через, 5 – 10 мс после импульсного облучения (длительность импульса 7 мс.) уже не модифицировала эффекта, наблюдавшегося в аноксии. Подтверждение этому получено и после усовершенствования методи­ки эксперимента: оказалось, что усиление эффекта становится несу­щественным даже при добавлении кислорода через 2 мс после облуче­ния.

Аналогичные данные о временных факторах проявления КЭ полу­чены на клетках млекопитающих. В конце 70-х годов было показано, что при подведении кислорода к фибробластам китайского хомячка всего через 0,3 мс после облучения ККУ уменьшается с 2,6 (в случае присутствия кислорода в момент облучения) до 1,5. Если же кислород подводили спустя 5 мс после облучения, то ККУ снижался до 1,1. Для получения максимальной сенсибилизации в этих экспериментах кислород надо было подавать в камеру за 1—2 мс до начала облуче­ния. По-видимому, это время было необходимым для того, чтобы кис­лород мог продиффундировать к «критическим» внутриклеточным структурам.

Согласно данным других исследователей, для достижения полной сенсибилизации клеток млекопитающих кислород должен подводиться еще раньше — не позднее, чем за 40 мс до облучения. Подача кислорода за 3—5 мс увеличивает радиочувствительность клеток не более чем в 1,7 раза.

Таким образом, практически сенсибилизирующее действие кис­лорода при облучении животных клеток может проявиться только тогда, когда он присутствует непосредственно в момент облуче­ния.

Несмотря на универсальность феномена КЭ в живых системах и даже при облучении ДНК учет только содержания кислорода оказывается недостаточным. В этих случаях КЭ, тестируемый, например, по инактивации (т. е. утрате биологической активности) ДНК или фагов в растворе, или по гибели клеток, прояв­ляется только в присутствии SH-соединений. Последние конкурируют с кислородом за потенциальные повреждения, возникающие в ДНК, разделяя их судьбу: при фиксации кислородом они, как упоминалось выше, реализуются в явные повреждения — инактивацию, а при взаимодействии с SH-группой исчезают, и молекула возвращается в исходное состояние.

Напряжение кислорода мм. рт.ст.

Рис. III.24. Зависимость радиочувствительности клеток от содержания кислорода (% от атмосферного) и егопарциального давления при 37˚ C.

1 - 3 мм рт. ст. или 1—2% О₂, 2 – воздух, 3 - 100% О₂; остальные объяснения см. в тексте

Весьма важно рассмотреть зависимость КЭ от концентрации кислорода. Так как еще не разработаны надежные методы измерения внутриклеточного содержания кислорода, соответствующий контроль проводят в окружающей среде. Как правило, для этого используют методы электродной полярографии и по значениям pO₂ (измеряется электродом, помещаемым в питательную среду при измерениях в клеточных культурах или в ткани в экспериментах in vivo) судят о концентрации кислорода в клетке. Учитывая скорость диффузии кислорода и малыеразмеры большинства клеток млекопитающих, есть все основания считать получаемую информацию достаточно надежной.

На рис. III.24 представлена классическая зависимость КЭ от концентрации кислорода, впервые экспериментально установленная Л. Греем с сотрудниками в 50-х годах. Отложенная на ординате величина ККУ характеризует относительную радиочувствительность (за единицу принято ее значение в аноксии). В атмосферном воздухе при температуре 37 °С содержится по объему 20,92 % O₂, что соответствует ~159 мм. рт. ст. На рис. III.24 показано, что при этом давлении радиочувствительность уже максимальна, обычно она близка к трем и не увеличивается при повышении концентрации кислорода до 100%. С уменьшением парциального давления кислорода (pO₂) вначале вплоть до 30 мм орт. ст., радиочувствительность уменьшается очень медленно, а затем более резко; в диапазоне 3—4 мм рт. ст. ККУ составляет два и далее снижается до единицы.

Связь между концентрацией кислорода во время облучения и радиочувствительностью, представленная графически на рис. III.24, аналитически выражается уравнением, предложенным Т. Альпер и П. Говард-Фландерсом:

,

где 1/ D ₀[O] и 1/ D ₀[A] - величины, характеризующие радиочувствительность, при изучаемой концентрации кислорода (O) или аноксии (A), m - максимальная величина ККУ, К - константа, равная концентрации кислорода, при которой радиочувствительность является промежуточной между максимальной и минимальной. (Когда опыты ставят в ограниченном диапазоне доз, что не позволяет точно определить D ₀, а также в исследованиях in vivo, в которых критерием эффекта является поражение всего организма или определенных тканей, а не выживаемость отдельных клеток, ККУ определяют сравнением равно эффективных доз при каких-то определенных уровнях выживаемости.) В примере, приведенном на рис. III.24, величина К составляет 3 мм рт. ст. или ~ 0,5 % О₂, а m = 3.

Рис. III.25. Зависимость кислородного эффекта от вида ионизирующих излучений. А — рентгеновское излучение; Б— нейтроны с энергией 15 МэВ; В — α-излучение (по Дж Барендсену и др., 1966. 1967)

Как и действие химических модификаторов поражения, КЭ наиболее выражен при действии редко ионизирующих излучений. С повышением ЛПЭ он быстро уменьшается и при облучении, например, α-частицами исчезает (рис. III.25).

Общая связь КЭ с ЛПЭ представлена на рис. III.26. Как показали работы последних лет, величина m для разных видов клеток варьирует в диапазоне 2—4. Различия в величине K также велики. Так, для микроорганизмов К равняется 4—6 мкМ кислорода (0,3—0,45 % кислорода в газовой фазе) или 2,5—3 мм рт. ст., а для зародышей пыльцы традесканции и клеток корешков конских бобов - соответственно около 10 и 4 мкМ. Сильно варьируют эти величины и для клеток млекопитающих. Так, по данным разных авторов, обобщенным Б. Каллен и Д. Лансли, колебания m и K составляют соответственно 2,5 - 4,0 и 2,0 - 6.0 мм рт. ст. Поэтому не следует переносить количественные зависимости КЭ, полученные in vitro, на все многообразие лучевых реакций животных, тем более что на величине КЭ может сказываться состояние репарирующих систем, а также физиологический статус клеток, особенно в составе организма.

Рис. III.26. Кислородный эффект как функция ЛПЭ, данные по­лучены на культуре клеток почки человека (по Дж. Барендсену, 1966):

темными кружками обозначены тяжелые моноэнергетические частицы, треугольником - рентгеновское излучение 250 кВ, имеющее среднюю ЛПЭ 1.3 кэВ/мкм

Рис. III.27. Связь m с D₀ в азоте для 11 мутантов Е. coli, дефектных по репарации (по Т. Альпер, 1968)

На рис. III.27 приведена зависимость КЭ от радиочувствительности в азоте для 11 мутантов Е. coli с дефектами репарации, отражающимися на радиочувствительности. Видно, что m при этом изменяется от 1,5 до 4. Как показали дальнейшие исследования О. Сапоро (1977) на оди­нарных и двойных бактериальных мутантах по репарации, КЭ соста­вил соответственно 2,1—2,4 и 1,3 по сравнению с 3 для бактерий дикого типа.

В вышеизложенных данных действие кислорода, присутствующего во время облучения, рассматривали как радиосенсибилизирующее. Однако уже в 60-х годах выяснили, что присутствие кислорода в среде после облучения, напротив, способствует репарации радиационных повреждений. Причем на историческом примере изучения роли кислорода в восстановлении жизнеспособности облученных клеток можно продемонстрировать важность методических аспектов проведения любых экспериментов.

В ранних работах M. Элкинда была показана способность клеток к восстановлению при замене после облучения воздуха на азот, в котором примесь кислорода составляла всего 16 частей на 1 млн. частей азота. Эти данные привели авторов к построению концепции чисто «физико-химического» механизма восстановления, для которого не требуется участия ни энергии, ни кислорода. В последующем, однако, выяснилось, что эти результаты — артефакт, обусловленный применением посуды из полистирола, в котором много растворенного кислорода, диффундирующего к клеткам после замещения воздуха на инертный газ. При замене пластмассы на стекло и использовании хорошо очищенных газов восстановление полностью подавлялось — при содержании 1 части кислорода на 1 млн. частей азота на дозовой кривой исчезало плечо. Увеличение количества кислорода в смесях до 10 частей приводило к появлению плеча, что свидетельствовало о способности клеток к восстановлению, которая увеличивалась с повышением содержания кислорода.

Рис. III.28. Восстановление сублетальных повреждений за время t между фрак­циями в зависимости от концентрации кислорода в среде (асинхронная популяция клеток китайского хомячка (СНО), облучение в дозе, вызывающей 4%-ную выживаемость) (по К. И. Ко­ху, 1979):

1 - воздух, 2 - 200 млн^-1O₂, 3- 25 млн^-1O₂, 4 - 25 млн^-1O₂

На рис. III.28 представлена кинетика восстановления сублеталей при разных концентрациях кислорода в промежутках между фракциями облучения. В аноксических условиях при [O₂] < 25 млн^-1 восстановления не происходит. С ростом концентрации кислорода скорость восстановления увеличивается и при содержании кислорода в газовой фазе 1000 млн^-1 она почти достигает максимума.

Таким образом, кислород выступает при лучевом поражении биообъектов в роли двуликого Януса — с одной стороны, усиливает первичное поражение, а с другой — облегчает пострадиационное восстановление. Относительное значение того и другого аспекта модифицирующего действия кислорода может меняться в зависимости от конкретных условий эксперимента и должно с максимальным вниманием учитываться для правильного истолкования результатов.

Различия в величине КЭ, связанные с функциональным состоянием, в частности с интенсивностью дыхания и видом энергообмена, показаны в последнее время на разных клетках млекопитающих.

Что понимают под аддитивностью, синергнзмом и потенцированием эффектов?

Что такое ФИД и каковы методы его определения?

Что понимают под кислородным эффектом и каковы методы его оценки?

Какова зависимость кислородного эффекта от концентрации кислорода?

Какова связь кислородного эффекта с ЛПЭ?

Как влияет кислород на процессы пострадиационного восстановления?

Знание некоторых принципов легко возмещает незнание некоторых фактов.

К. Гельвеций.

Связь ОБЭ с ЛПЭ. Методы оценки ОБЭ. Эффект «перепоражения». ОБЭ и кислородный эффект. Другие факторы, влия­ющие на величину ОБЭ. Огра­ничения в концепции ОБЭ.