Реакция клетки на облучение. Клеточная радиочувствительность

В результате облучения, повреждающего абсолютно все внутриклеточные структуры, в клетке можно зарегистрировать множество самых разнообразных реакций — задержку деления, угнетение синтеза ДНК, повреждение мембран и др. Степень выраженности этих реакций зависит от того, на какой стадии жизненного цикла клетки произведено облучение.

Синтез ДНК в клетке происходит в интерфазе, занимая в ней определенный промежуток времени. Это позволило разделить ннтерфазу на три периода — период синтеза ДНК (S-период), пред- и постсинтетические периоды (соот­ветственно G₁ и G₂) ( От англ. Gap — интервал. ) Митоз, чет­вертый период цикла, обозначается буквой М. Продолжительность жиз­ненного, или митотического, цик­ла — время между двумя последова­тельными делениями клетки — сла­гается из отдельных стадий, дли­тельность которых в разных тканях варьирует относительно друг друга по величине, располагаясь, как пра­вило, следующим образом: М < G₂ <S < G₁ (рис. III.4).

Рис. III.4. Митотическнй цикл:

М - митоз, G₁ - предсннтетическнй пе­риод, S - период синтеза ДНК, G₂ - постсинтетический период. G₀ - фаза покоя (клетка может переходить в нее либо после завершения синтеза ДНК, либо по окончании митоза; в фазе покоя клетка находится до тех пор, пока некоторый стимул не побудит ее снова вступить в цикл соответственно в G₂ - или G₁ -периоды)

В активно обновляющихся тканях (эпителий ворсинок кишеч­ника, костный мозг, кожа и др.), а также в быстрорастущих опу­холях и клеточных культурах продолжительность цикла составляет от 10 до 48 ч. Наиболее продолжительны периоды G₁ и S, а самый кратковременный период — митоз — завершается в большинстве слу­чаев в течение 30 — 60 мин.

В малообновляющихся тканях большинство клеток находится в G₁ -периоде, длительность которого измеряется неделями, а иногда ме­сяцами и даже годами (например, в ЦНС), что в последнее время обус­ловило выделение еще одной стадии — G₀; клетки, находящиеся на этой стадии, принято считать вне цикла, или покоящимися. Такие клет­ки составляют резерв репопуляции в случае гибели части клеточного пула от различных причин. Таков, например, механизм посттравмати­ческой регенерации тканей или возобновления роста опухо­ли после ее облучения.

Многие из лучевых реакций клетки легко переносятся клеткой, так как являются следствием повреждения множественных структур, утрата которых очень быстро восполняется или просто остается незамеченной. Такие преходящие клеточные реакции называют физиологическими или кумулятивными эффектами облучения. К ним относятся различные нарушения метаболизма, в том числе ингибирование нуклеинового обмена или окислительного фосфорилирования, слипание хромосом и др.

Как правило, подобные реакции проявляются в ближайшие сроки после облучения и с течением времени исчезают. Наиболее универсальная из них — временная задержка (угнетение) клеточного деления, часто называемая в литературе радиационным блокированием митозов. Снижение числа делящихся клеток после облучения было замечено уже вскоре после открытия рентгеновских лучей, что и послужило одним из оснований к применению этих лучей для подавления опухолевого роста. Эта реакция к настоящему времени наиболее хорошо изучена в количественном отношении на самых разнообразных объектах в экспериментах in vivo и in vitro для большого числа нормальных клеток и тканей, а также для опухолей человека и животных.

Рис. III.5. Динамика размножения клеток после облучения в разных до­зах. А и А' — икра вьюна; Б и Б' — яйца морского ежа; В и В' — поч­кование дрожжей (по В. И. Корогоднну, 1964):

A, А', 1 — необлученные зиготы. 2, 3, 4, 5— облученные (300 Гр) сперматозоиды, яйцеклетки, сперматозоиды и яйцеклетки до оплодотворения, зигота тотчас после оплодотворения соответственно:

Б, Б'. 1 — необлученные, 2, 3, 4— сперматозоиды, облученные непосредственно перед оплодотворением (1, 2, 10 Гр соответственно);

В, В', 1 — необлученные. 2, 3 — облученные 160 н 180 Гр соответственно

Проведенные эксперименты показали, что длительность за­держки деления зависит от дозы ионизирующего облучения и проявляется у всех клеток облученной популяции, независимо от дальнейшей судьбы той или иной клетки — выживет она или погибнет. Однако продолжитель­ность этого эффекта различна у разных объектов, что нагляд­но представлено на рис. III.5, где сведены и проанализированы результаты экспериментов ряда исследователей. Во всех случаях после облучения деление клеток дрожжей прекращалось и возоб­новлялось спустя некоторое вре­мя, различное у разных объек­тов, но всегда растущее с дозой облучения. У каждого из объек­тов кривые первого пострадиационного деления имеют почти такую же форму, как и кривые соот­ветствующих контрольных (необлученных) клеток, и лишь сдвинуты по оси абсцисс вправо. Это особенно хорошо видно при представлении данных в координатах «пробит-эффект — логарифм времени».

(Термин «пробит» происходит от англ. probability unit — вероятностная единица. Пробит-анализ — количественная оценка экспериментальных данных, основанная на изучении зависимости между логарифмами доз и пробитами, соответствующими наблюдавшимся эффектам. В этих координатах S-образные или, как их называют, сигмоидные кривые выпрямляются.)

Рис. III.6 Сдвиг максимума митотической активности клеток почки человека при облучении в S-периоде (по И. Скайф v, 1969);

стрелками показан сдвиг волны деления при соответствующей дозе облучения, Гр.

Многочисленные исследования показали, что для большинства изученных культур клеток задержка деления соответствует примерно 1 ч на каждый 1 Гр, т. е. около 0,6 мин на каждый сГр. Следовательно, эта реакция на облучение идентична у всех особей однородной популяции не только качественно, но и по величине, причем с увеличением дозы возрастает не доля реагирующих особей, а продолжительность задержки деления каждой облученной клетки. В этом состоит принципиальное отличие такого рода клеточных эффектов облучения от летальных поражений, анализ которых будет проведен ниже.

Время задержки деления клеток зависит и от стадии клеточного цикла, в которой находятся клетки при облучении; наиболее длительно оно в тех случаях, когда воздействию подвергаются клетки в стадии синтеза ДНК или в постсинтетической стадии, и самое короткое - при облучении в митозе, когда абсолютное большинство клеток, начав митоз, заканчивает его без задержки.

Из-за различий в длительности задержки деления, наблюдающейся на отдельных стадиях клеточного цикла, восстановление митотической активности при облучении активно пролиферирующих тканей происходит волнообразно, так как эти ткани представляют собой асинхронную клеточную популяцию, т. е. состоящую из клеток, находящихся на разных стадиях жизненного цикла.

Из рис. III.7 видно, что через 4 ч после облучения клеточное деление еще сильно подавлено, степень угнетения пропорциональна дозе. Восстановление митотической активности клетки происходит волнообразно, причем картина при всех использованных видах ионизирующих излучений однотипна.

Вскоре после первоначального падения митотический индекс достаточно резко повышается, иногда даже достигая исходного уровня, а затем вновь снижается. Это начальное повышение еще не является истинным увеличением количества митозов. Объяснением этому служит тот факт, что под влиянием облучения некоторые клетки запаздывают со вступлением в деление, что отражается в снижении митотического индекса сразу после облучения. Вероятно, эти клетки в момент облучения находились на наиболее чувствительной к излучению (по данному критерию) стадии интерфазы. Затем они начинают делиться, причем одновременно с клетками, которые к моменту облучения находились на менее чувствительной стадии, и потому вступили в митоз в обычное время. Так образуется компенсаторная волна увеличения митотического индекса, которая иногда может превышать исходные показатели. С увеличением дозы облучения и компенсаторная волна, и новое значение митотического индекса еще долго оказываются меньшими по сравнению с исходными, что объясняется подавлением способностей клеток к делению.

Рис. III.7 Динамика митотической активности костного мозга мышей после общего облучения.

Цифрами у начала кривых обозначены дозы облучения

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о роли радиационного повреждения ядра (большей, чем цитоплазмы) в механизме угнетения клеточного деления; в то же время установлено, что оно не связано с повреждением хромосом.

Можно рассматривать задержку деления как проявление неспецифического компонента реакции клеток на облуче­ние (тем более что она наблюдается в ответ на действие многих внешних факторов), имеющее защитно-приспособительный характер.

(Американский цитолог Д. Мэзия в предисловии к монографии, посвящен­ной физиологии клеточного деления, справедливо заметил, что «...обобщения дают возможность улавливать доказательства существования некоего общего плана (иными словами, осмысленности явления), которые может поставить нам природа».)

Суждение о защитном характере задержки митозов основано на том, что продолжительность задержки отражает меру восстановления клеток от вызванных излучением поражений, например, путем разрушения гипотетических токсинов или ресинтеза метаболитов, необходимых для деления. В этом случае следовало бы ожидать, что чем больше времени есть у клетки для восстановления, тем вероятнее, что она успешно раз­делится и даст жизнеспособное потомство. Однако прямые наблюдения показали, что степень задержки митозов одинакова как для гибнущих, так и для сохранивших жизнеспособность клеток. Отсутствие связи между задержкой деления и гибелью клетки подтверждается и данными о разной величине ОБЭ для этих феноменов (И. Скайф, 1969), и разнонаправленным изменением радиочувствительности и задержки деления по стадиям цикла.

До сих пор нет достаточных данных для того, чтобы однозначно отнести задержку деления к проявлениям радиационного повреждения множественных внутриклеточных структур или оценить ее как защитную реакцию клеток на их повреждение;

Все сказанное относится к временной задержке первого пострадиационного деления, наблюдаемой после облучения в определенном, хоти и достаточно большом диапазоне доз (для большинства клеток млекопитающих в пределах 10 Гр). Еще менее изучен механизм задержки деления при повторных облучениях, а потому и более затруднена интерпретация.

Описываемую реакцию задержки деления следует отличать от полного подавления митоза, наступающего после воздействия больших доз, когда клетка значительное время продолжает жизнь, но необратимо утрачивает способность к делению. В результате такой необратимой реакции на облучение часто образуются патологические формы гигант­ских клеток, иногда даже содержащие несколько наборов хромосом вследствие их редупликации в пределах одной и той же не разделившейся клетки (эндомитоз).

Среди многих проявлений действия излучения на жизнедеятельность клетки подавление способности к делению явля­ется наиболее важным. В связи с этим под клеточной гибелью, или ле­тальным эффектом облучения, в радиобиологии понимают утрату клеткой способности к пролиферации. Наоборот, выжившими клетка­ми считают те, которые сохранили способность к неограниченному размножению, т. е. к клонообразованию. Таким образом, речь идет здесь о репродуктивной гибели клеток. Репродуктивная форма луче­вой инактивации клеток наиболее распространена в природе, Она же и лучше изучена методами количественной радиобиологии в связи с тем, что ее можно наблюдать при культивировании клеток вне орга­низма.

При наблюдении за облученными клетками линии L (мышиных фибробластов) было установлено, что их гибель происходит как в про­цессе 1-го пострадиационного деления, так и во 2-м, 3-м и 4-м митозах. На рис. 17 схематически показана судьба потомков одной клетки, облученной в дозе 2 Гр. Их гибель (фрагментация) наблюдалась толь­ко через 70 и 140 ч после облучения исходной клетки, т.е. соответственно после 2-го и 3-го деления. После облучения в дозе 4 Гр клетки линии L более чем в 80% случаев успешно заканчивали 1-е пострадиационное деление, но зато вероятность деления дочерних клеток (1-я генерация) и «внучек» (2-я генерация) составляла около 30%; остальные 70 % клеток, начав деление, погибали.

Другая разновидность репродуктивной гибели потомков облученных клеток — формирование так называемых гигантских клеток возникающих в результате слияния двух соседних, чаще «сестринских» клеток. Такие клетки способны не более чем к 2—3 делениям, после чего они погибают. Гигантские клетки могут возникнуть без слияния при длительной задержке истинного деления (эндомитоз) облученных клеток или их потомков. Такие клетки также нежизнеспособны.

Какие же реакции приводят делящиеся и малодифференцированные клетки к гибели? Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения ДНК, возникающие под влиянием облучения. Они легко обнаруживаются, в частности, цитологическими методами в виде так называемых хромосомных перестроек или аберраций хромосом. При этом разорванные хромосомы могут соединяться неправильно, а очень часто отдельные фрагменты их просто теряются при делении. Возникающие хромосомные перестройки весьма разнообразны. Отметим лишь основные виды аберраций: фрагментация хромосом, формирование хромосомных мостов, дицентриков, кольцевых хромосом, появление внутри- и меж хромосомных обменов и т.п.Часть аберраций, как, например, мосты, механически препятствует делению клетки; появление обменов и ацентрических фрагментов приводит к неравномерному разделению хромосом и утрате генетического материала, вызывающей гибель клетки из-за нехватки метаболитов, синтез которых кодировался ДНК утраченной части хромосомы.

Рис. III.8. Результаты наблюдения за потомками клетки линии L, облучен­ной на 5-стадии (по К. tpottv, 1969):

1 — гибель клетки. 2 — слияние двух кле­ток с образованием гигантской клетки

Долю клеток с хромосомными перестройками часто используют в качестве количественного показателя радиочувствительности, так как, с одной стороны, число таких перестроек четко зависит от дозы облуче­ния, а с другой — они, отражая летальное действие излучений, хоро­шо коррелируют с выживаемостью клеток.

Итак, рассмотренные виды лучевой инактивации клеток, насту­пающей после первого пострадиацнонного митоза и ведущей к прекращению клонобразования, называют репродуктивной или митотической формой гибели.

Другая форма радиационной инактивации клеток — интер­фазная гибель — наступает до вступления клетки в митоз. При очень больших дозах облучения это происходит непосредствен­но «под лучом» или вскоре после облучения. В диапазоне умерен­ных доз (до 10 Гр) гибель наступает в первые часы после облуче­ния и может быть зарегистрирована в виде различных дегенеративных изменений клетки; чаще всего под микроскопом через 2—6 ч можно наблюдать клетки с резким пикнозом ядра и фрагментацией хроматина.

Для размножающихся клеток в культуре ткани, а также для большинства клеток соматических тканей взрослых животных и человека интерфазная гибель регистрируется только после облучения при дозах в десятки и сотни грей. При меньших дозах наблюдается репродуктивная форма гибели, причиной которой, как упоминалось, в большинстве случаев являются структурные хромосомные повреждения.

Количественный метод определения выживаемости клеток, млеко­питающих после облучения впервые был разработан в 1956 г. Т. Паком и П. Маркусом для культуры клеток HeLa. Так как и по сей день он является основным методом, применяемым в количественной радио­биологии, будет подробно рассмотрен его первоначальный вариант, а также описаны некоторые дальнейшие его усовершенствования.

Клетки снимают со стенок культурального сосуда раствором трипсина или версена (рис. III.9), пипетируют до получения взвеси из строго одиночных клеток и рассеивают по чашкам Петри так, чтобы в каждую чашку попало заданное коли­чество клеток. На каждую дозу облучения и контроль берут по 5—8 чашек. После посева чашки с клетками облучают при нескольких дозах вплоть до 10— 20 Гр и выращивают в термостате 7—14 дней до получения видимых невооружен­ным глазом колоний, содержащих не менее 50 клеток. Следовательно, облучен­ная, но сохранившая жизнеспособность клетка и ее потомки должны совершить не менее шести последовательных делений. Выживаемость клеток при каждой до­зе облучения определяют как отношение числа колоний, выросших в облучен­ных чашках, к числу колоний, выросших в контроле (рис. III.9).

Рис. III.9. Техника клонирования кле­ток для определения их выживаемо­сти после облучения (по методу Т. Пака, Р. Маркуса):

/ — в две серии чашек Петри высевают одинаковое число клеток; //

опытные чашки облучают, контрольные — нет;

///

через 10—14 дней выжившие клетки делятся и образуют видимые колонии (клоны)

Полученная по такому методу кривая выживания растущих в куль­туре клеток опухоли Эрлиха (линии EL.D) приведена на рис. III.10.

Рис. III.10. Выживаемость клеток ELD при действии γ-излучения ('"Cs) в культуре:

точками показаны результаты отдельных экспериментов

В настоящее время радиобиологи имеют возмож­ность в эксперименте количественно оценивать радиочувствительность многих тканей и опухолей, сравнивая кривые выживания клеток после облучения (в том числе in vivo).

Существуют и другие критерии радиочувствительности, хорошо коррелирующие с выживаемостью, но прежде чем они будут описаны, необходимо остановиться на общем анализе кривых выживания.

Какова зависимость задержки деления клеток от дозы облучения?

Чем определяется волнообразный характер восстановления митотической активности после облучения активно пролиферирующнх тканей?

В чем состоит правило Бергонье и Трибондо?

Что понимают под летальным эффектом облучения клетки?

В чем отличие репродуктивной от интерфазной формы гибели?

Расскажите о методах оценки клеточной радиочувствнтельности, осно­ванных на изучении их способности к неограниченному размножению.

Кривые выживания самых различных клеток при действии рентге­новского, гамма- или любого другого редко ионизирующего излучения имеют форму, аналогичную приведенной на рис. III.10.

Рис. III.11. Кривые выживания клеток (кривые доза—эффект) при действии плотно ионизирующего излучения. А — ли­нейные координаты; Б — полулогарифмические координаты:

пунктиром обозначена 37%-ная вы­живаемость

Рис. III.12 Основные параметры кривой выживания (объяснение см. в тексте)

В системе полулогарифмических координат (дозу облучения откладывают по шкале абсцисс в нелинейном масштабе, а выживаемость на оси ординат в логарифмическом) кривая состоит из так называемого плеча и линейного участка, начинающегося обычно после доз 3—5 Гр.

Для упрощения последующих рассуждений необходимо отметить, что при облучении клеток плотно ионизирующими частицами кривые их выживания не имеют плеча и в полулогарифмических координатах прямолинейны на всем своем протяжении (рис. III.11).

Такая зависимость хорошо описывается уравнением вида ,

где N — число выживших клеток из общего их числа, D — любая доза облучения, D ₀ — доза, при которой доля живых клеток уменьшается в сравнении с исходной в е раз: N/N ₀ = е^-1 = 1/2,71 = 0,367. Таким образом, при дозе облучения, равной D ₀, выживает ~37%, а погиба­ет ~63 % клеток.

Величина D ₀ служит мерой радиочувствительности клеток и опреде­ляется по кривой выживания как доза, при которой выживает ~37 % клеток от исходного количества. Иногда поэтому ее называют D ₃₇, что в случае экспоненциальных кривых одно и то же, но для кривых, имеющих плечо, величины D ₀ и D ₃₇, различны (рис. III.10).

Графическое представление данных (см. рис. III.8 - III.10) определяет бытующее иногда представление о существовании некоей «критической дозы», при которой якобы погибают все клетки, так как экстраполяция кривой выживания в полуло­гарифмическом масштабе приводит к пересечению с осью абсцисс. На самом деле при возрастании дозы облучения фракция выживших клеток (или вероятность выживания) лишь асимптотически стремится к нулю.

Представление о критической дозе, однако, не лишено смысла: при облуче­нии ткани, где клетки находятся в близком контакте друг с другом, те из них, которые пережили облучение, могут погибнуть за счет автолиза и выхода фермен­тов из соседних клеток. Есть основания полагать, что снижение фракции выжив­ших клеток до Ю^-6 — Ю^-7 (при этом в 1 см³ остается от 100 до 1000 живых кле­ток) приводит к полной гибели всех клеток под действием других (не связанных с облучением) процессов, и соответствующая доза облучения может рассматри­ваться как критическая. Для клеток, не контактирующих друг с другом, на­пример находящихся в асцитной жидкости лейкозных клеток, представление о критической дозе неприменимо.

Кривые, имеющие плечо (см. рис. III.8, III.10), кроме величины D ₀, определяющей наклон ее линейного участка, характеризуются еще и так называемым экстраполяционным числом п. Оно опре­деляется в месте пересечения ординаты экстраполированным пря­молинейным участком кривой выживания. Здесь величина D ₀ определяется как инкремент (приращение) дозы, снижающей выживаемость в е раз на прямолинейном участке кривой выжи­вания.

Мерой способности клеток к репарации является величина плеча, оцениваемая квазипороговой дозой D _q. Она измеряется длиной отрезка прямой, параллельной оси абсцисс, проведенной на уровне 100%-ной выживаемости от оси ординат до точки пере­сечения с экстраполированным участком кривой выживания (см. рис. III.10).

Летальные реакции клеток имеют специфиче­скую особенность, отличающую их от рассмотренных выше обратимых преходящих клеточных эффектов.

Эта особенность состоит в том, что с увеличением дозы облучения увеличивается не только (и даже не столько) степень поражения всех облученных клеток, как это имеет место, например, в отноше­нии задержки деления, сколько доля пораженных, т. е. погиб­ших, клеток. Иными словами, с одной стороны, даже при самых малых дозах может быть зарегистрирован экстремальный эффект - гибель клетки (разумеется, с малой вероятностью), сдругой - и при очень больших дозах (опять же с малой вероятностью) могут сохраниться отдельные жизнеспособные клетки.

Одним из часто используемых количественных методов оценки летального поражения пролиферирующих клеток служит подсчет числа клеток с аберрациями хромосом.

Согласно данным метафазного анализа (табл. III.1) существует полный параллелизм в изменении выживаемости клеток и долей безаберрантных клеток при облучении клеточной культуры, синхронизированной на отдельных периодах интерфазы, а также в условиях защиты или сенсибилизации. Из табл. III.1 видно, что при дозах облучения, различающихся даже в 9 раз, но вызывающих одно и то же подавление жизнеспособности клеток, одинаковой оказывается и доля безаберрантных клеток.

Из табл. III.1 также следует, что доля клеток без хромосомных аберраций несколько меньше доли выживших клеток, способных к образованию колоний. Это может быть объяснено тем, что некоторые аберрации обусловливают гибель только одного из потомков облученной клетки, вызывая образование неполноценных абортивных колоний. Близкое соответствие кривых гибели и снижения числа клеток аберраций хромосом наблюдается и при учете аберраций не в метафазе, а в анафазе (см. также рис. III.11).

Таблица III.1. Корреляция между аберрациями хромосом и выживаемостью клеток китайского хомячка при разных условиях облучения

Рис. III.11. Выживаемость (A) и доля клеток без аберраций хромосом (Б) при облучении культуры клеток китайского хомячка:

1 — γ-нзлучение ¹³⁷Cs, 2 — протоны 200 МэВ

На рис. III.11 в отличие от данных, представленных в табл. III.1, число клеток без аберраций здесь несколько больше числа выживших клеток. Это определяется тем, что анафазный метод выявляет не все аберрации (по некоторым данным, в два раза меньше, чем метафазный), например, потому, что фрагменты увлекаются расходящимися хромосомами в анафазные «шапки», где их нель­зя обнаружить. Но и в этом случае существует соответствие характера кривых, а одинаковое снижение эффекта облучения при переходе от γ-излучения к протонам высоких энергий, выявляемое по обоим крите­риям, также свидетельствует о связи аберраций хромосом с клеточной гибелью. Отсутствие полного соответствия между выживаемостью кле­ток и возникновением аберраций (во многих работах отмечено 20 — 30%-ное расхождение между уровнем погибших и аберрантных клеток) не умаляет роли аберраций хромосом в качестве пригодного ко­личественного критерия клеточной радиочувствительности.

При анализе причин летального радиационного поражения клетки следует, прежде всего, рассмотреть вопрос об относительной радиочувствительности двух основных ее компонентов — ядра и цитоплазмы.

Можно утверждать, что результаты абсолютного большинства многочисленных исследований дали весьма убедительные доказательства о несравненно большей радиочувствительности ядра и решающей роли его поражения в исходе облучения клети. Поскольку и сейчас приходится встречаться с противниками этой точки зрения, ниже будут приведены наиболее убедительные примеры доказательства ее справедливости. Рассмотренная выше корреляция между долей клеток с хромосомными аберрациями и летальным эффектом свидетельствует в пользу определяющей роли ядерного материала в исходе лучевого поражения клетки. Однако этот факт сам по себе еще нельзя однозначно интерпретировать как следствие большей радиочувствительности ядра, ибо можно предположить, что повреждения хромосом могут происходить и в результате опосредованных цитоплазматических влияний.

Рис. III.12. Схема опытов Б. Л. Астаурова (объяснение см. в тексте)

Прямые доказательства большей радиочувствительности ядра по сравнению с цитоплазмой были получены позже и другими исследова­телями в опытах с прицельным облучением ядра на объектах, в клетках которых оно строго фиксировано. Оказалось, нап­ример, что попадание уже од­ной α-частицы в ядро опло­дотворенного яйца насекомого (наездника) вызывает гибель зародыша, которая в случае облучения цитоплазмы яйца регистрируется лишь после прохождения 15 млн. α-частиц.

Особый интерес представ­ляют также эксперименты, в которых с помощью микропучка протонов (90% частиц находилось в поле диаметром 5 мкм) было показано, что структурные повреждения хромосом в клетках наступа­ют уже после непосредствен­ного их облучения 15—20 протонами, в то время как при облучении различных участков цитоплазмы сотнями тысяч частиц его влияния не обнаружено.

Приведенные примеры наглядно демонстрируют значительно большую радиочувствительность ядра по сравнению с цитоплазмой, однако они не отвергают роль последней в радиационном поражении ядерного аппарата. Более того, существует достаточно много экспериментальных данных о зависимости проявления и размера ядерных нарушений от степени облучения цитоплазмы, что является следствием сложных и пока малоизученных ядерно-цитоплазматических отношений. Важно, что для разных объектов удельный вес прямого поражения ядра и опосредованных влияний может сильно различаться, отражая особенности жизнедеятельности целых клеток и функционирования их основных органелл.

Итак, подводя итог современному состоянию этого вопроса, следует подтвердить правильность точки зрения о решающей роли поражения ядра как первопричины лучевой гибели клетки и его несравненно большей по сравнению с цитоплазмой радиочувствительности. Однако в реализации летального клеточного эффекта несомненна и роль цитоплазмы, которая выражена неодинаково у разных объектов и зависит от их функционального состояния и внешних условий.

Какие же внутриядерные структуры ответственны за жизнеспособность клетки? Естественно, что при этом важны события и поражения, возникающие и определяемые при дозах до 10 Гр, существенных для гибели млекопитающих, ибо в принципе не существует структур, не поражаемых при облучении: все зависит от использованной дозы.

В клетке содержится несколько десятков молекул ДНК, имеющих очень большую длину. (У млекопитающих на клетку приходится 3·10⁹ — 6·10⁹ пар нуклеотидов, общая длина молекул ДНК при этом составляет от 1 до 2 м.). ДНК постоянно связана с белками, которые участвуют в поддержании структуры интерфазного хроматина, формировании хромосом и переносе генетической информации.

Облучение вызывает различные повреждения ДНК и ее комплексов. К их числу относят разрывы молекулы ДНК, образование щелочно-лабильных связей, потерю оснований и изменения их состава, изменения нуклеотидных последовательностей, сшивки ДНК—ДНК и ДНК—белок, нарушения комплексов ДНК с другими молекулами.

Различают одиночные разрывы, когда связь между отдельными атом­ными группировками нарушается в одной из нитей двунитчатой молекулы ДНК, и двойные, когда разрыв происходит сразу в близких участках двух цепей, что приводит к распаду молекулы. При любом разрыве нарушаются считывание информации с молекулы ДНК и простран­ственная структура хроматина.

Одиночные разрывы не приводят к поломкам молекулы ДНК, так как разорванная нить прочно удерживается на месте водородными, гидрофобными и другими видами взаимодействий с противоположной нитью ДНК и, кроме того, структура довольно хорошо восстанавлива­ется мощной системой репарации. Многие авторы поэтому склонны ду­мать, что одиночные разрывы сами по себе (если они не переходят в двойные) не являются причиной гибели клеток.

При дозах до 20 Гр двойные разрывы являются следствием одновременного повреждения обеих нитей ДНК. С увеличением дозы облу­чения, более того, возрастает вероятность перехода одиночных разры­вов в двойные, так как увеличивается возможность того, что независи­мые разрывы в противоположных цепях возникают друг против друга, При действии излучений с небольшой плотностью ионизации (γ- и рентгеновское излучение, быстрые электроны) 20—100 одиночных разрывов вызывают один двойной.

Плотно ионизирующие излучения вызывают значительно большее число двойных разрывов. Такие виды лучевого поражения макромоле­кул удается регистрировать непосредственно после облучения в виде аберраций хромосом.

Расчеты показывают, что уже при дозе 1 Гр в каждой клетке че­ловека повреждается 5000 оснований молекул ДНК, возникает 1000 одиночных и 10 - 100 двойных разрывов, каждый из которых может стать причиной возникновения аберрации.

Исходя из этих представлений, выживаемость клеток во многих случаях может быть описана с помощью, так называемой линейно-квад­ратичной модели Чедвика и Линхаутса. Разрабатывая модель, авторы исходили из того, что при облучении клеток летальными являются двойные разрывы ДНК, которые появляются либо в результате одно­сменного разрыва обеих спиралей ДНК одной ионизирующей частицей, либо в результате совпадений двух независимо образовавшихся одиночных разрывов комплементарных спиралей, оказавшихся напротив друг друга.

Согласно этой модели выживаемость клеток S выражается формулой , где D - поглощенная доза, а α и β — параметры, характеризующие вероятность индукции и репарации разрывов ДНК в облученных клетках. (Данная модель позволяет во многих случаях более точно аппроксимировать экспериментальные данные о выживаемости клеток, чем при использовании формулы с параметрами D ₀ и n. Однако наглядность последних и удобство их оценки определяет более широкое использование параметров D ₀ и n, чем α и β.)

Кроме образования разрывов в облученной ДНК нарушается структура оснований, прежде всего тимина, что увеличивает число генных мутаций. Отмечается образование сшивок между ДНК и белком нуклеопротеинового комплекса.

Разработанные к настоящему времени методы позволяют в ряде случаев обнаружить радиационные нарушения в структуре интерфазного хроматина уже при облучении клетки дозой в несколько грей. Так, вязкость интерфазного хроматина в клетках тимуса уменьшается после облучения в дозе 1—2 Гр, а при дозе 1 Гр отмечается подавление синтеза РНК, вызванное нарушениями дезоксирибонуклеопротеинового комплекса.

В последние годы интенсивно исследуется ДНК-мембранный комплекс — сложное структурное образование в области соединения нитей ДНК с ядерной мембраной, в состав которого помимо ДНК входят белок и липиды (рис. III.13). Как показывают данные М. Элкинда и соавторов (1972), распад комплекса и деградацию молекул ДНК можно зафиксировать после облучения клеток китайского хомячка при дозе всего 2 Гр.

Помимо структурных нарушений ДНК в облученной клетке наблюдается нарушение регуляции, прежде всего выдачи в цитоплазму информации от ДНК, а также нарушение функционирования многочисленных внутриклеточных мембран. В этом проявляется роль внеядерных органелл, а также сложных взаимоопределяющих влияний ядра и цитоплазмы.

Многие сложные процессы клеточного метаболизма протекают именно на мембранах, так как последние позволяют обеспечить нужное пространственное разделение реагирующих молекул. Не удивительно, что радиочувствительными оказываются именно те биохимические процессы, для которых необходима пространственная организация участвующих групп ферментов. Снижение энергетического обмена клетки, вызванное поражением митохондрий, в отдельных случаях удается наблюдать после облучения в дозах, равных нескольким Греям. Кроме того, нарушение целостности мембран может приводить к сдвигу ионного баланса клетки из-за выравнивания концентраций калия и натрия (в норме клетка накачивает внутрь калий и высвобождает в окружающую среду натрий), что также неблагоприятно отражается на ходе метаболических процессов.

Рис. III.13. Основные виды структурных радиационных повреждений:

1 - однонитчатые (одиночные) разрывы в молекуле ДНК, 2 - двунитчатые (двойные) разрывы ДНК, 3 - нарушение связи ДНК с белком, 4 - повреждение структуры ДНК мембранного комплекса, 5 - разру­шение ядерной мембраны, 6 - повреждение мнтохондриальной мембра­ны

Наконец, важным последствием облучения является изменение эпигеномной (не связанной с ядерным материалом) наследственности клетки, носителем которой служат различные цитоплазматические органеллы. При этом снижается функциональная активность потом­ков облученных клеток, в чем может состоять одна из причин отдален­ных последствий облучения. Однако главной причиной ре­продуктивной формы гибели клеток при облучении является поврежде­ние ее генетического аппарата.

Охарактеризуйте основные параметры кривой выживания.

В чем отличие кривых выживания при действии редко- и плотноионизирующих излучений?

В чем принципиальное различие дозовой зависимости летальных реакций клеток от аналогичной зависимости для обратимых клеточных реакций, например задержки деления?

В чем смысл классических экспериментов Б. Л. Астаурова, доказываю­щих определяющую роль ядра в радиочувствительности клетки?

Охарактеризуйте типы радиационных повреждений ДНК. Какие из них являются причиной аберраций хромосом?

Многие радиационные повреждения репарируются. Здесь это явление будет рассмотрено на клеточном уровне.

Феномен пострадиационного восстановления обусловлен тем, что при облучении в клетках, среди прочих, возникают и такие повреждения, которые обычно приводят клетку к гибели, но при определенных условиях могут быть устранены системами ферментативной репарации. Такие повреждения принято называть потенциальными. Их дальнейшая судьба после возникновения двоякая: либо они репарируются, и тогда клетка выживает, либо реализуются, и тогда она гибнет.

Термин потенциальное повреждение — чисто формальное, феноменологическое понятие, так как не определяет какое-либо конкретное молекулярное повреждение, а потому может применяться к любому виду радиационных поражений. В отношении репродуктивной гибели клеток наиболее изучены два вида потенциальных повреждений - сублетальные и потенциально летальные, различающиеся по способу их выявления.

Сублетальные повреждения выявляют методом фракционированного облучения, а потенциально летальные — по изменению выживаемости клеток под влиянием изменения условий, в которых они находятся в первые часы после облучения. Например, не исключено, что частьдвойных разрывов ДНК, образовавшихся при облучении клеток в предсинтетический период, может быть восстановлена за время, оставшееся до репликации ДНК, а те из них, что клетка не успела «залечить» до момента синтеза ДНК, становятся летальными и вызывают ее гибель, образуя аберрации хромосом. Очевидно, что эффективность репарации, т. е. долю выживших клеток, можно увеличить, если искусственно удлинить период G ₁.

Влияние условий пострадиационного культивирования на последующую судьбу клеток показано многими авторами на различных объектах и в разные годы. Ф. Шерман и Г. Чейз еще в 1949 г. обнаружили увеличение выживаемости облученных дрожжей в том случае, если помещать их на питательную среду не сразу после облучения, а выдержав некоторое время в буферном растворе.

Только в 1959 г. В. И. Корогодину в четко поставленном эксперименте удалось воспроизвести тот же феномен, а главное, правильно объяснить его, доказав реальность существования истинного пострадиационного восстановления, что было зарегистрировано в качестве открытия.

Соответствующие опыты столь изящны по своей простоте и убедительности, что могут служить примером экспериментального мастерства.

После γ-облучения дрожжей штамма Мегри-139-В в дозе 1.2 кГр суспензию клеток разводили 1:10 000 и делили на две части. Из одной производили посев на питательную среду в чашки Петри сразу после облучения и оценивали выживаемость, подсчитывая колонии через 96 ч инкубации при температуре 30˚ С. Другую половину суспензии выдерживали после облучения в течение 48 ч в голодной среде при той же температуре, а затем рассеивали по чашкам. Оказалось, что в первом случае выживало лишь около 0,2 % облученных клеток, во втором - выживаемость наблюдалась почти у 40 %, причем во всех изученных пробах.

Результаты этих опытов, схема которых приведена на рис. III.14, можно рассматривать как прямое доказательство реальности пострадиационного восстановления дрожжевых клеток, способность к которому «внутренне присуща» облученным клеткам, и не зависит от наличия в популяции нелетально пораженных особей.

Рис. III.14. Схема опыта В. И. Корогоднна, доказывающая реальность существования пострадиационного восстановления дрожжевых клеток

Влияние условий пострадиационного культивирования клеток млекопитающих на их последующую судьбу продемонстрировано С. Н. Александровым (1959) на клетках рака молочной железы, выращиваемых в разных температурных условиях, а позднее И. М. Пархоменко (1963), которая помещала облученные клетки в фосфатный буфер илиингибировала синтез белка.

Во всех этих примерах речь идет о длительно (в течение нескольких часов) протекающих процессах — медленное восстановление. Hapяду с ними в клетке возникает и другой тип потенциально летальных повреждений, которые реализуются в летальные в течение нескольких минут после облучения. Как показали опыты У. Деви (1972), реализация такого типа поражений в клетках китайского хомячка происходит в условиях нормального метаболизма; снижение температуры среды до 20°С во время или сразу после облучения затормаживает процессы реализации, но не влияет на одновременно идущие восстановительные реакции, в результате чего поражение клеток уменьшается.

В 1981 г. А. В. Глазуновым и Ю. Г. Капульцевичем у дрожжей обнаружено и быстрое восстановление. Оказалось, что выживаемость диплоидных дрожжей при высеве их после облучения на питательную среду, содержащую 8 или 10% NaCl, зависит от температуры во время облучения: понижение температуры с 20 до 3 - 0°С приводит к существенному снижению выживаемости. Выдерживание клеток, облученных при 0°С, в воде при 28°С уже через 30—40 мин приводит к быстрому повышению выживаемости.

Эффект быстрого восстановления жизнеспособности нельзя обнаружить, облучая клетки при комнатной температуре или высевая их на стандартную питательную среду, так как в этих условиях восстановление успевает завершиться. Этот тип пострадиационного восстановления у дрожжей вносит большой вклад в регистрируемую выживаемость этих клеток в стандартных условиях (при высеве облученных клеток на стандартную питательную среду) в отличие от медленного пострадиационного восстановления.

Рис. III.15. Быстрое (1) и медленное (2) вос­становление жизнеспособности диплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae после γ-облучения в дозе 40 Гр

Для примера на рис. III.15 показана выживаемость дрожжей на солевой (10 % NaCl) (кривая 1) и стандартной (кривая 2) питательных средах в зависимости от времени выдерживания клеток в воде при 28˚ C. В первые 30—40 мин происходит быстрое увеличе­ние выживаемости клеток на солевой среде до постоянного значения, которое сохраняется в течение последующих одного - двух часов, что соответствует завершению быстрого пострадиационного восстановле­ния; дальнейший рост выживаемости обусловлен медленным восста­новлением, заканчивающимся через 40 - 50 ч. При высеве облученных клеток на стандартную питательную среду (без NaCI) можно наблю­дать лишь медленное восстановление жизнеспособности.

Быстрое восстановление наблюдали как после γ-облучения, так и после облучения α-частицами ²³⁸Pu. Рассматриваемый тип восстанов­ления, как и медленное, отсутствует у гаплоидных дрожжей, с чем ав­торы связывают повышенную радиочувствительность гаплоидных дрож­жей по сравнению с диплоидными.

Придавая большое научное и принципиальное значение рассмотрен­ному феномену репарации потенциально летальных повреждений дрож­жевых клеток, где он так сильно выражен, следует иметь в виду, что вклад такого типа репарации в повышение выживаемости клеток млеко­питающих оказывается несоизмеримо меньшим. В экспериментах in vitro показано, что выживаемость многих видов клеток млекопитаю­щих за счет восстановления от потенциально летальных повреждений может быть повышена не более чем в 2—3 раза (в зависимости от дозы).

В настоящее время еще не разработаны методы количественной оцен­ки репарации потенциально летальных повреждений непосредственно in vivo, однако в косвенных экспериментах получены убедительные дан­ные о реальности этого процесса и в организме. На многих перевивных опухолях экспериментальных животных показано, что выживае­мость опухолевых клеток, оцениваемая in vitro, зависит от времени их рассева после облучения самих опухолей in vivo. Так, например, вы­живаемость клеток асцитной или солидной опухоли Эрлиха при посеве клеток не сразу, а через 2 ч после облучения в дозе 10 Гр возрастает вдвое, а при посеве клеток некоторых фибросарком через 6 ч после об­лучения последних она увеличивается в 2—5 раз. Наблюдаемое в этих экспериментах возрастание выживаемости происходит благодаря репа­рации части потенциально летальных повреждений, что свидетельству­ет о существовании аналогичного процесса и в организме, количествен­ное выражение которого, по-видимому, может различаться у разных тканей.

Восстановление клеток китайского хомячка от сублетальных повреждений полностью проходит за 2 – 3 ч. У других клеток этот интервал может быть несколько большим; например, у клеток костного мозга мышей он равен 5 – 6 ч.

Характер кривых выживаемости клеток при фракционированном воздействии.

Рис. III.16. Восстановление плеча на кривой выживания клеток лимфомы мышей при повторном облучении (по Дж. Толмачу, 1970}:

1 - однократное облучение, 2 - повтор­ное облучение через 4 ч после первого

На рис. III.16 представлены результаты соответствующих экспериментов, свидетельствующие, что при повторном облучении клеток, сохра­нивших жизнеспособность после первого облучения, форма кривой их выживаемости (2) повторяет соответствующую кривую при однократном облучении (1). На ней вновь возникает плечо (величина которого при полном восстановлении не отличается от регистрируемого при пер­вом облучении), а наклон (т. е. D ₀) не изменяется. Аналогичным обра­зом величины указанных параметров не изменяются и при многократ­ном облучении, что проверено на разнообразных клетках в культуре ткани.

Иными словами, радиочувствительность выживающих после облучения клеток не отличается от контрольных, так как степень их восстановления (по данному критерию) не уменьшается при повторных экспозициях.

Эффективность восстановления (ЭВ) от сублетальных повреждений оценивают по величине так называемого фактора восстановления — отношения выживаемости клеток при фракционированном облучении к выживаемости при однократном облучении, или по величине разности доз двукратного (D ₂) и однократного (D ₁) облучения, требуемых для достижения одинакового эффекта (ЭВ = D ₂ – D ₁). В случае дробления дозы на N фракций формула имеет вид: ЭВ = (D ₂ – D ₁)(N — 1). Вели­чина фактора восстановления зависит от собственной интенсивности восстановления и от скорости перехода клеток в более чувствительные фазы цикла, причем эти процессы противоположно влияют на радиочувствительность клеток в момент 2-го облучения.

Фактор репарации сильно зависит также от дозы облучения, при­чем как от первого, так и от последующих. Если доза недостаточно ве­лика и не выходит за пределы D _q, репаративные возможности клетки не могут полностью выявиться и фактор репарации невелик.

Способность к восстановлению при фракционированном облуче­нии хорошо коррелирует с ве­личиной плеча, поэтому такие параметры кривой выжива­ния, как п и особенно D _q, поз­воляют предсказать степень поражения различных тканей при повторных облучениях, что и используют на прак­тике. Отсутствие плеча на кривой выживания, как это имеет место, напри­мер, при воздействии плотноионизирующими излуче­ниями или при использова­нии некоторых модифициру­ющих агентов, свидетель­ствует об ингибировании про­цессов репарации или образовании нерепарируемых по­вреждений.

Наиболее изучена репарация структурных повреждений ДНК, которым приписывают большую роль в клеточной гибели. Такие повреждения ДНК, как одно- и двунитевые разрывы, могут быть количественно определены в разное время после облучения специальными методами, например, с помощью седиментации ДНК в градиенте плотности сахарозы после мягкого лизиса клетки.

Основные типы репарации.

По времени осуществления различают дорепликативную, пострепликативную и репликативную репарации.

Дорепликативная репарация (до этапа удвоения ДНК) может происходить путем воссоединения разрывов, а также с помощью удаления (эксцизии) поврежденных оснований. В воссоединении одиночных разрывов участвует несколько ферментов. В простейшем случае разрывы могут быть воссоединены лигазой. В других ситуациях требуется полная ферментативная система репарации, включающая специфические эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимеразу, ДНК-лигазу, а также вспомогательные ферменты, обеспечивающие подготовку концов ДНК для заключительного акта репарации — лигазного воссоединения.

Исследованиями, проведенными на бактериальной ДНК, выявлены три типа репарации одиночных разрывов — сверхбыстрая, быстрая и медленная. Сверхбыстрая завершается в течение 1—2 мин и обеспечивается одной ДНК-лигазой. Быстрая репарация, осуществляемая с помощью ДНК-полимеразы 1, воссоединяет 90% разрывов, остающихся после сверхбыстрой репарации. Время воссоединения половины разрывов составляет в зависимости от температуры от 1 до 10 мин. Медленная репарация завершается за 40—60 мин, воссоединяя около двух разрывов на каждую цепь ДНК, оставшихся после сверхбыстрой и быстрой репараций.

Феномен репарации двухнитевых разрывов в ДНК впервые был обнаружен у Micrococcus radiodurens, а в последние годы показан и на клетках млекопитающих. В клетках HeLa полное восстановление молекулярной массы ДНК наступает в течение 2,5 ч пострадиационной инкубации. Механизм этого вида репарации неясен, а сам эффект восстановления двойных разрывов долго вообще не удавалось наблюдать, хотя в последние годы он был показан в ряде лабораторий.

Наряду с разрывами ДНК после облучения возникают множественные повреждения оснований, последние ликвидируются системой эксцизионной репарации, проходящей с помощью репаративного синтеза, который представляет собой многоэтапный процесс типа выщепление - замещение. В начале повреждение узнается специфической γ-эндонуклеазой, после чего происходит выщепление (инцизия) поврежден­ного участка вблизи измененного основания, затем - экзонуклеотическая деградация поврежденной цепи с захватом смежных неповреж­денных нуклеотидов и, наконец, - репаративный синтез в области образовавшегося дефекта при участии ДНК-полимеразы 1 и полинуклеотидлигазы комплементарного участка неповрежденной цепи ДНК в качестве матрицы (шаблона).

Пострепликативная репарация постулируется на основании то­го факта, что некоторые клетки млекопитающих выживают при большой дозе облучения, несмотря на пониженную способность к удалению пиримидиновых димеров. Механизм этого вида ре­парации точно не изучен, предполагают разные варианты синте­за ДНК на поврежденной матрице.

Репликативная репарация — восстановление ДНК в процессе ее репликации. Этот тип репарации осуществляется удалением в хо­де репликации повреждений в зоне точки роста цепи либо про­должающейся элонгацией в обход повреждений.

К настоящему времени, несмотря на значительный прогресс в изуче­нии проблемы репарации, нерешенными остаются многие вопросы, ка­сающиеся молекулярных механизмов этого процесса и его роли в пострадиационной выживаемости клеток. Результаты соответствующих экспериментов показывают, например, что связь восстановления жиз­неспособности клетки с репарацией одиночных разрывов ДНК не безусловна. С одной стороны, последняя заканчивается в течение получаса, т. е. быстрее, чем восстанавливается сама клетка, а с другой — полная репарация разрывов наблюдается и при очень больших дозах, составляющих десятки грей, когда выживают лишь одиночные клетки. Еще нет строгих данных о том, что «отремонтированная» ДНК обладает абсолютно теми же свойствами, что и исходная. (В равной степени это относится и к восстановлению клеток, регистрируемому по их выживаемости, ибо при этом неизвестна функциональная активность таких выживших клеток, а тем более судьба их потомков в отдаленные сроки.)

Как уже было показано, репарация повреждений ДНК - процесс метаболический; она осуществляется ферментами, постоянно присутствующими в клетке, участвующими, как в ее нормальном метаболизме, так и в реакциях восстановления от различных (не только радиационных) повреждений. Эти мощные репарационные системы, по всей видимости, ликвидируют и большую долю радиационных повреждений ДНК.

Поскольку пострадиационная репарация — процесс ферментативный, ее интенсивность, а, следовательно, и судьба облученной клетки зависят от общего уровня клеточного метаболизма.

Для работы ферментов репарации требуется энергия. Если образование АТФ подавить, например, фторидом натрия, то скорость восстановления снижается. При небольшом уменьшении общей скорости метаболизма, например, понижением температуры до комнатной, эффективность восстановления не меняется. При снижении температуры до 20°С наблюдается временная задержка в восстановлении некоторых клеток. Интенсивность восстановления значительно снижается при 8˚С, а при 2 - 5°С — приостанавливается.

Ферментативная природа репарации определила и применение для ее изучения ингибиторов различных синтетических процессов. Однако при анализе их действия на молекулярном и клеточном уровнях получены весьма противоречивые результаты, что в основном определяется множеством метаболических процессов, обусловливающих репарацию особенно в клетках высших организмов.

Несмотря на многообразие репарационных процессов, весьма вероятно, что природа сублетальных и летальных повреждений одинакова. Согласно точке зрения М. Элкинда репарация в клетке начинается сразу после облучения, причем если повреждения не слишком тяжелы, то некоторые из них клетка может отрепарировать и, таким образом, сохранить жизнеспособность в смысле неограниченного размножения. Тяжелые же, множественные повреждения полностью отрепарировать клетке не удается. Если 2-е облучение отстоит во времени от 1-го, то таких тяжелых повреждений возникает меньше, ибо повреждения от 2-го облучения образуются в клетках, частично уже восстановившихся после 1-го облучения. В результате общее число повреждений оказывается меньшим, чем при эквивалентной дозе однократного об­лучения, и соответственно большим будет число выживших клеток. Следовательно, клетка, которая выживет после однократного облуче­ния за счет репарации от потенциально летальных повреждений, вновь приобретает способность накапливать сублетальные повреждения, т.е. ее радиочувствительность становится такой же, как и у необлучен­ной клетки.

Несмотря на привлекательность такого унитарного подхода и неко­торые подтверждающие экспериментальные данные, нет достаточных оснований для его безоговорочного признания. Поэтому принятые термины остаются в силе, хотя может оказаться, что «отличия» субле­тальных повреждений от потенциально летальных можно свести к раз­личиям в методах их регистрации.

Выше было показано, что самые разнообразные лучевые реакции клетки (задержка митоза, индукция хромосомных аберраций, степень угнетения синтеза ДНК и др.) зависят от стадии ее жизненного цикла.

Теперь, завершая главу о клеточной радиочувствительности, сле­дует ясно представлять, что вероятность летального исхода для облу­ченной клетки определяется совокупностью многих факторов и про­цессов, а реализация последних, в свою очередь, зависит от ряда усло­вий, в которых пребывает клетка в момент облучения, особенно от ста­дии клеточного цикла.

Выживаемость клеток при облучении их на разных стадиях цик­ла закономерно меняется, что свидетельствует о различии в радиочувствительности этих стадий. Самыми радиочувствительны­ми клетки оказываются во время митоза. Дальнейшее изменение радиочувствительности несколько различно у разных видов кле­ток, однако, как правило, она минимальна (а выживаемость максимальна) при облучении в конце S -стадии, где радиочувствительность примерно на порядок ниже, чем при митозе (рис. III.17 А).

Такой характер изменения распределения радиочувствительности по циклу не универсален. Детальное изучение последствий облучения клеток китайского хомячка линии V -79, проведенное У. Синклером, обнаружило у них только один максимум радиорезистентности, приходящейся на конец S-периода (рис. III.17 Б). Выживаемость клеток, облученных в этот момент, в 40 раз выше, чем при облучении в митозе. Особняком находятся данные, полученные при изучении различных линий клеток L (фибробластов мыши), у которых период G ₁ намного радиорезистентнее, чем периоды S и G ₂.

Рис. III.17. Радиочувствительность клеток на разных стадиях цикла. A - клетки HeLa; Б — китайского хомячка линии V-79 (по У. Сннклеру, 1970)

Рис. III.18. Радиочувствительность отдельных стадий цикла кле­ток китайского хомячка линии V -79 при разных дозах облу­чения (обозначены цифрами у кривых, Гр) (по У. Синклеру, 1970)

Рис. III.19. Кривые выживаемости кле­ток китайского хомячка линии V-79 при облучении на разных стадиях цикла (по У. Синклеру, 1970)

Таким образом, в обычной асинхронной популяции клетки могут быть подразделены на ряд субпопуляций с разной радиочувствительностью. Зная чувствительность клеток на разных фазах цикла и долю клеток в каждой из этих фаз, можно рассчитать радиочувствительность всей популяции. Следовательно, радиочувствительность ткани и кле­точной популяции может быть изменена рядом факторов, меняющих распределение клеток по стадиям цикла (такое воздействие называет­ся синхронизацией), даже если чувствительность самих клеток при этом не меняется. Следует иметь в виду еще одно обстоятельство, ко­торое не всегда учитывается даже в специальной литературе. Оказыва­ется, что различия в радиочувствительности отдельных фаз цикла вы­ражены в разной степени при разных дозах облучения.

Причина этого явления состоит в изменении формы кривых выжи­ваемости клеток, облученных на разных стадиях цикла. При переходе от митоза к стадии S способность к репарации возрастает - увеличиваются плечо и экстраполяционное число п и снижается радиочувствительность - уменьшается наклон кривой выживания и соответственно увеличивается D ₀ (рис. III.19, табл. III.5).

Таблица III.5. Параметры кривых выживания клеток китайского хомячка при облучении на разных стадиях цикла (по У. Синклеру, 1970)

Различия в выживаемости сильно увеличиваются с возрастанием дозы облучения, что и приводит к зависимости, изображенной рис. III.18.

В настоящее время отсутствуют адекватные методы оценки основных радиобиологических параметров покоящихся клеток in vivo. Соответствующие данные об этих свойствах получены в основном путем экстраполяции результатов экспериментов с облучением стационарных культур, используемых в качестве модели покоящихся клеток. Согласно этим данным если и существуют различия в радиобиологических свойствах между клетками, покоящимися и находящимися в цикле, то они невелики. Например, есть сведения о том, что клетки в стационарном состоянии не восстанавливаются от сублетальных повреждений. Однако клетки приобретают эту способность в том случае, если после 1-го o6лучения их поместить в оптимальные условия развития — в свежую полноценную среду с небольшой плотностью клеток. Известны данные и об отсутствии различий в лучевых реакциях покоящихся клеток in vivo. Например, установлена одинаковая степень радиочувствительности хромосом покоящихся и делящихся клеток печени. Анализ и оценка этих работ будут проведены в соответствующих главах при рассмотрении вопросов восстановления организма и отдаленных эффектов облучения.

Что такое потенциальные радиационные повреждения клетки?

Какими методами выявляют сублетальные и потенцнально-летальные повреждения?

Расскажите об экспериментах М. Элкинда и В. И. Корогодина.

Какова радиочувствительность клеток на разных стадиях цикла?

Тому, кто упорно ищет, часто удается что-нибудь обнаружить, хотя и не всегда имен­но то, что он ищет.

А. Моруа

Можно ли искусственно моди­фицировать радиочувствительность биологических объектов: сделать их по желанию более устойчивыми к действию излу­чения или, напротив, усилить их поражение? Средства ослабления и усиления лучевых ре­акций; протекторы и сенсиби­лизаторы. Количественные кри­терии модификации радиочувствительности. Кислород - уни­версальный радиомодифицирующий агент. Кислородный эф­фект.