Глава 1. Применение серологических реакций для диагностики инфекционных болезней и идентификации микроорганизмов

Иммунологические реакции in vitro (в пробирке) используют в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний и иммунологических исследованиях. Метод диагностики инфекционных заболеваний, основанный на определении специфических антител в сыворотке крови, называется серологическим.

Серологические реакции применяют в двух направлениях:

• Выявление с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого при наличии набора известных антигенов. В качестве антигенов применяют взвеси микроорганизмов, инактивированные химическими или физическими методами, или используют диагностикумы, представляющие фракции микроорганизма. Как правило, результаты серологической диагностики получают при исследовании парных сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через определенные промежутки времени от начала заболевания.

• Определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма или его антигенов с известными иммунными сыворотками. Иммунные сыворотки должны содержать антитела в высоком титре и быть строго специфичными. В лабораторной практике применяют серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация) и опосредованные реакции (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента), а также реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флуоресцирующих антител).

Процесс взаимодействия антигена с антителом протекает в две фазы.

Специфическая фаза — это взаимодействие, при котором происходит комплементарное соединение активных центров антител и антигенов. Процесс длится от нескольких секунд до нескольких минут. Специфической фаза названа потому, что с антигеном, попавшим в организм, может соединиться только подходящее к нему (комплементарное) антитело.

Неспецифическая фаза — это проявление внешних признаков образования иммунных комплексов (помутнение, выпадение осадка и так далее). Длится от нескольких минут до нескольких часов.

Внешние проявления реакции антитело-антиген зависят от многих факторов: от физико-химических свойств антигена (размеры, физическое состояние), от класса и вида антител, от условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, pH, температура). Поливалентность (способность образовывать больше двух связей) антител и антигенов обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это можно объяснить тем, что к образовавшемуся комплексу антиген-антитело могут присоединяться другие молекулы антител и антигенов на свободные активные центры. В результате формируются довольно крупные агрегаты, которые могут выпасть в осадок.

Еще одной особенностью является то, что наиболее интенсивно реакции антиген-антитело проявляются, если компоненты находятся в эквивалентных соотношениях, то есть лишних антител и антигенов после реагирования не остается.

Иммунологические реакции благодаря высокой специфичности и чувствительности применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Для выявления неизвестного антигена используют диагностические иммунные антисыворотки. Их получают путем многократной иммунизации лабораторных животных известным антигеном. Обнаружение антител проводят с использованием известных антигенов, которые представляют собой взвесь убитых микроорганизмов, инактивированных высокой температурой, химическими веществами, ультразвуком, рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым облучением.

Реакция агглютинации

Реакции агглютинации — это реакции склеивания корпускулярных антигенов (микробы, эритроциты и т.д.) специфическими антителами. Образовавшийся при этом комплекс выпадает в осадок. Эти реакции проводят для определения наличия определенных антигенов или антител. На стекле к капле сыворотки добавляется взвесь бактерий, выделенных из организма или трупа.

Если капля мутнеет, значит, агглютинация произошла и в организме присутствует тот антиген, к которому были антитела (известные) в исходной сыворотке. Также эту реакцию проводят в пробирке: в несколько пробирок наливают исследуемую сыворотку крови с неизвестными антителами, потом к этим образцам добавляют известные диагностикумы (убитые бактерии) и наблюдают, в какой пробирке произойдет помутнение или выпадет осадок.

Реакция агглютинации — взаимодействие антител с антигенами — является двухфазной: в первой фазе происходит специфическое связывание антигена и антитела, во второй — осаждение образовавшегося агрегата, являющегося гидрофобным, солями. Основываясь на этом представлении, принято разделять агглютинины на полные и неполные. Неполные антитела — агглютинины, которые в среде физиологического раствора NaCl не могут осаждать клетки или частицы, даже если они связываются с ними. Классификация агглютининов, основанная на методах их выявления:

• полные агглютинины;

• неполные агглютинины:

– блокирующие антитела, определяемые в тесте блокирования,

– агглютиноиды, определяемые в среде сыворотки, плазмы, альбумина,

– неполные антитела, выявляемые с помощью антиглобулиновой реакции — Coombs,

– криптагглютиноиды, выявляемые после предварительной обработки эритроцитов ферментами,

– агглоиды, обнаруживаемые с помощью коллоидных посредников (поливинилпирролидон, желатина, декстран и др.).

Полные и неполные агглютинины находятся в основном в γ-глобулиновой фракции сыворотки крови. В процессе иммунизации вначале появляются полные антитела, в случае продолжающейся сенсибилизации появляются антитела, способные вызвать агглютинацию лишь при определенных условиях.

Полные и неполные антитела имеют отличительные признаки по физико-химическим свойствам и серологической характеристике. Так, неполные антитела более термостабильны по сравнению с полными, в то время полные менее устойчивы и снижают свою активность даже при хранении в замороженном состоянии. Полные антитела имеют большую авидность к соответствующим антигенам, чем неполные антитела.

Реакция гемагглютинации (агглютинация эритроцитов)

Реакция агглютинации широко используется для обнаружения антиэритроцитарных антител (определение групп крови), а также антигенов в исследуемых образцах эритроцитов или тканей с помощью специфических антисывороток.

Агглютинация в солевой среде — наиболее простой метод выявления полных агглютининов, реакцию можно проводить как на планшетах (более быстрый метод), так и в пробирках (для более точного количественного учета антител в сыворотке).

Для реакции необходимы исследуемая сыворотка или сыворотка известной специфичности и взвесь эритроцитов, приготовленная из свежевзятой крови, отмытой от примеси плазмы физиологическим раствором NaCl. С этой целью в пробирку с 8–10 мл физиологического раствора NaCl берут несколько капель крови, перемешивают и центрифугируют в течение 5–7 мин при 3000 об/мин. Затем сливают надосадочную жидкость, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор до нужного объема, перемешивают путем встряхивания и вновь центрифугируют. После троекратного отмывания из осадка эритроцитов готовят 2–5%-ную взвесь эритроцитов в физиологическом растворе хлористого натрия.

Агглютинация в пробирках (планшете для агглютинации). В ряд агглютинационных пробирок (кроме первой) вносят по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. Затем в первую и вторую пробирки добавляют по 0,1мл (2 капли) сыворотки и, начиная со второй пробирки, переносят после перемешивания пипеткой по 0,1 мл (2 капли) разведенной сыворотки в каждую последующую пробирку, получая, таким образом, ряд разведений сыворотки, кратных 2. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 мл (1 капля) 2% взвеси эритроцитов. В качестве контроля берут нормальную сыворотку и физиологический раствор с используемой взвесью эритроцитов.

После встряхивания пробирки помещают в термостат при температуре 37 °C на 30 мин – 1 час или выдерживают при комнатной температуре (18 °C) либо при температуре 4 °C (в зависимости от задач исследователя). После инкубации проводится оценка реакции без предварительного центрифугирования по форме осадка или после центрифугирования (при 1500 об/мин в течение одной минуты) по характеру сгустка. Для более точного учета реакции используют агглютиноскоп или просматривают под малым увеличением микроскопа или лупой. Оценка интенсивности агглютинации проводится по следующей схеме.

Резко выраженная агглютинация (++++). При встряхивании комочек эритроцитов не разбивается, жидкость совершенно прозрачна. Под микроскопом все поле зрения занято одним агглютинатом.

Умеренная агглютинация (++). Осадок при встряхивании разбивается на несколько отдельных комочков, небольшая часть эритроцитов находится в свободном состоянии и хорошо выявляется под микроскопом.

Слабая агглютинация (+). Агглютинаты мелкие, большая часть эритроцитов взвешена в жидкости. Под микроскопом на фоне отдельных эритроцитов видны небольшие агглютинаты.

Отрицательная реакция (–). Гомогенная мутная взвесь эритроцитов в жидкости, под микроскопом склеенные эритроциты не выявляются.

Наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается агглютинация эритроцитов, принимается за титр агглютининов.