Глава 2. Генодиагностика. Полимеразная цепная реакция в идентификации патогенных бактерий

К числу наиболее чувствительных и высокоспецифичных иммунологических методов обнаружения антигенов относится метод полимеразной цепной реакции, который позволяет обнаруживать в исследуемом материале присутствие нескольких молекул искомого антигена или единичных возбудителей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) —метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией) ПЦР позволяет осуществлять множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

История. В начале 1970-х гг. норвежскому ученому Къеллу Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Har Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 г. Кери Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за нее Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. она была существенно улучшена. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у нее достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации) с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определенных условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20–40 тысяч пар нуклеотидов. Это все равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

Компоненты реакции. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;

• два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;

• термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов: Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и др.

• буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — pH, ионную силу раствора; содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофософатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

Праймеры. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18–30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг) последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже). Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Она определяется как температура, при которой праймер присоединился к половине возможных сайтов связывания.

Если праймер короткий и Tm мала, то праймер может оказаться частично комплементарен другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев: GC-состав ~ 40–60 %; близкие Tm праймеров (отличия не более чем на 5 °C); отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров; желательно, чтобы на 3'-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

Амплификатор. ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью горячего старта, Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Ход реакции. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20–35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.

Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94–96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5–2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2–5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4–5 °C ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5–2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7–10 мин.

Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n, где n — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1 + E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

Разновидности ПЦР:

• «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

• «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

• ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

• Асимметричная ПЦР (Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

• Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

• Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

• Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле; PCR + Colony, Polony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

• ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR), ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (т.е. способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.

• ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК (Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, RAPD-PCR) — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20–25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н — А, Т или С.

Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминология. ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (genetic fingerprint).

Установление отцовства. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных, бактериальных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Высокие показатели чувствительности и специфичности полимеразной цепной реакции (ПЦР) делают ее революционной в лабораторной диагностике. Показания к применению ПЦР такие же, как и у культурального метода. Следует учитывать, что при исследовании биопроб методом ПЦР сразу после курса антибактериального лечения в некоторых случаях можно получить «ложноположительные с клинической точки зрения» результаты, поскольку невозможно однозначно оценить жизнеспособность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только молекулярно-биологические методы, поскольку амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма.

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Диагностические возможности ПЦР не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Преимущества ПЦР как метода диагностики

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов, г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую нуклеиновую кислоту (НК), если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300–500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем: диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности — «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99–100 %.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм.

Проведенная в нескольких зарубежных исследо­вательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые», или экспресс-тесты имеют чувствительность 40–60 %, ИФА — 50–70 %, прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) — 55-75%, культуральное исследование — 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%.

Поэтому ПЦР по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

• Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

• Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

• Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце.

• Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

• Возможность доклинической и ретроспективной диагностики ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. в серонегативной фазе, или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

• Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

• Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

• Возможность экспертизы — полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

Ошибки при использовании метода ПЦР

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Случаи тотальной контаминации выявляются без труда по появлению линии «положительной» ДНК во всех пробах, включая отрицательный контроль. Реагенты, загрязненные «положительной» ДНК, подлежат ликвидации. Повторная реакция ставится с новыми реагентами.

Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов.

Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа с результатами других исследований, например с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА). Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела. При хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией, такая картина бывает нередко.