Серологическая идентификация микоплазм

Реакция иммунофлуоресценции. Данный метод серологической идентификации микоплазм может быть использован в различных модификациях: окраска отпечатков колоний на предметных стеклах, препаратов из бульонных культур, колоний на дис­ках мембранных фильтров, микоплазм в гистосрезах, клеточных структу­рах. Общие принципы идентификации микроорганизмов прямым и непря­мым методом иммунофлуоресценции изложены в разделе «Серологические реакции». Методика идентификации микоплазм в микроколониях на мемб­ранных фильтрах описана в разделе «Микоплазмоз свиней». Наибольшее применение получил метод иммунофлуоресцентного окрашивания колоний на плотных средах, который оценивают как более специфический, чем тес­ты ингибиции роста и метаболизма. Реакцию иммунофлуо­ресцентного окрашивания колоний на агаровой среде (эпифлуоресценция) проводят следующим образом. В чашки с агаровой средой высевают дроб­но 0,1-0,2 мл бульонной культуры, инкубируют посевы при 37° С в тече­ние 3-5 дней, вносят в чашку 2 мл буферного раствора на 30 минут, слива ют, вносят 2 мл меченой сыворотки (прямой вариант) в рабочем титре, вы­держивают при 37° С 30 минут, сливают копъюгат, трижды промывают буферным раствором, после чего просматривают колонии под люминес­центным микроскопом. Колонии, связавшие гомологичные антитела, ярко флуоресцируют. При постановке реакции в непрямом варианте на первом этапе колонии обрабатывают немеченой иммунной кроличьей сывороткой, промывают буфером, наносят антикроличью люминесцирующую сыворот­ку, инкубируют при 37° С 30 минут, сливают конъюгат, трижды промыва­ют буфером и исследуют колонии под люминесцентным микроскопом.

С целью экономии дорогостоящих компонентов реакцию рекомендуется проводить с колониями на агаровых блоках. Отбирают участок агаровой среды с изолированными колониями, вырезают блок размером 5x5 мм, наносят на предметное стекло, фиксируя его смесью парафина (65%) и вазелина (35%). На одном стекле можно помещать 6-10 блоков. Затем на каждый блок наносят каплю фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), удаляют избыток буфера. Наносят на блок каплю немеченой кроличьей сыворотки в рабочем разведении и инкубируют 30 минут при комнатной тем­пературе во влажной камере. Отмывают препарат дважды в буферном ра­створе по 10 минут. Удаляют буфер с каждого блока и наносят на блоки антикроличью меченую сыворотку в рабочем титре, инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Отмывают препарат двукратно, по
10 минут в буферном растворе, и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Для идентификации колоний на плотных средах рекомендует агаровые блоки помещать на предметное стекло колониями вниз. Затем стекла помещают в водяную баню с температурой 85° С до расплавления агара, при этом колонии фиксируются, затем препарат до­полнительно фиксируют 10 минут ацетоном и далее окрашивают по непря­мому варианту.

Тест ингибиции роста. Основан на ингибиции роста микоплазм специфической иммунной сы­вороткой в жидкой или плотной питательной среде (употребляют для иден­тификации на уровне вида). Требует наличия достаточно активных, моно­специфических, неконсервированных иммунных сывороток. Антисыворот­кой (0,025 мл), при проведении теста на плотных питательных средах, про­питывают диски фильтровальной бумаги диаметром 6 мм непосредственно перед использованием или хранят их в высушенном состоянии при -20° С. Для тестирования берут чистую культуру концентрацией 10^-4 -10^-5 КОЕ, которую в объеме 0,2 мл равномерно распределяют по поверхности плот­ной питательной среды. Чашки выдерживают 1 час при 22-37° С и затем на поверхности агара помещают диски с антисывороткой. Лучшие резуль­таты получают на срезах с субоптимальными концентрациями сыворотки и дрожжевого экстракта. Быстрорастущие микоплазмы дают меньшую зону задержки роста. Зону задержки роста измеряют от края диска. Зону задер­жки менее 2 мм оценивают как сомнительный результат. При проведении теста ингибиции роста в жидкой или полужидкой среде предва­рительно готовят двукратные разведения иммунной и контрольной (нор­мальной) сывороток в объеме 0,2 мл на изотоническом растворе натрия хлорида, добавляют 0,2 мл культуры микоплазм, содержащей 10²-10³ КОЕ, смесь выдерживают при комнатной температуре, добавляют к ней 1,6 мл питательной среды и инкубируют 72-96 часов. За титр принимают максимальное разведение сыворотки, ингибирующее рост.

Тест ингибиции метаболизма. Может быть проведен на базе любой реакции, отражающей фермента­тивную активность идентифицируемой микоплазмы. Условием должно быть наличие определенного фермента. В качестве субстратов обычно исполь­зуют глюкозу (1%), аргинин (0,1%), мочевину (1%), тетразолий хлорид (0,33%) в жидкой питательной среде. В готовой питательной среде готовят двукратные разведения иммунных сывороток и в пробирку с каждым раз­ведением вносят 0,1-0,2 мл исследуемой культуры микоплазм (10²-10³ КОЕ/мл). Контролем служат засеянные пробирки без антисыво­ротки. Посевы инкубируют 3-5 суток и путем сравнения опытных и конт­рольных пробирок делают заключение о специфической ингибиции антите­лами той или иной метаболической реакции.

Реакция диффузионной преципитации. Используют растворимый антиген, например полученный путем двад­цатикратного замораживания и оттаивания суспензии микоплазм. Реакцию ставят обычным способом. Готовят про­бойником лунки диаметром 3 мм на расстоянии 5 мм, в центральную лунку вносят антиген, в периферические — сыворотки. Учет результатов прово­дят через 48 часов. С гомологичной сывороткой антиген дает обычно не­сколько линий преципитации, с гетерологичными — редко одну, слабо вы­раженную.

Кроме перечисленных серологических реакций используют для иденти­фикации некоторых видов микоплазм иммуннопероксидазный тест, РСК. В последние годы с успехом апробирована для указанных целей реакция цеп­ной полимеризации. Штаммы M.gallisepticum, а также M.synoviae, M.meleagridis и других птичьих микоплазм имеют внутривидовые вариа­ции антигенных и вирулентных свойств, что может быть выявлено путем электрофореза белков в полиакриаламидном геле, гибридизацией ДНК.