Питательные среды для культивирования микоплазм

Транспортная среда для микоплазм. Дистиллированная вода — 800 мл, PPLO-бульон — 16,8 г, сыворотка крови лошади — 200 мл, 50%-ный дрожжевой экстракт — 10 мл, DNA (Sigma) — 0,02 г, пенициллин — 2000 ед./1 мл среды, ацетат талия — 1:100 000. Среду разливают по 2 мл в пробирки.

Приготовление дрожжевого экстракта для среды Friss. 125 г дрожжей суспендируют в 750 мл деионизированной воды, выдер­живают 20 минут при 37° С, помещают на 5 минут в кипящую воду, остужа­ют, центрифугируют, стерилизуют супернатант фильтрованием, хранят в замороженном виде.

Приготовление дрожжевого экстракта для культивирования M.hyosynoviae. 250 г дрожжей суспендируют в 1000 мл деионизированной воды, далее поступают так же, как и при изготовлении экстракта для среды Friss.

Среда Фрея. Основной PPLO-бульон — 22,5 г, декстроза — 10 г, свиная или лоша­диная сыворотка¹ —100—150 мл, феноловый красный —
25 мг, натриевая соль пенициллина G —1000 ед/'мл, ацетат таллия (1:4000 —1:2000) — 2,5 — 5,0 мл 10%-ного раствора, дистиллированная вода — 1000 мл. Устанавли­вают рН 7,8 и стерилизуют фильтрацией.

Модифицированная среда Фрея. Основной PPLO-бульон — 22,5 г, декстроза — 3,0 г, свиная сыворот­ка — 120 мл, цистеина гидрохлорид — 0,1 г, никотинамид-аденин-динук-леотид (NAD)²— 0,1 г, феноловый красный — 1%-ного раствора 2,5 мл, ацетата таллия 10%-ного раствора — 5 мл, натриевой соли пенициллина G 1 000 000 ед, дистиллированная вода — 1000 мл. Устанавливают рН 7,8 при помощи 20% NaOH, фильтруют стерилизацией.

Плотная среда Фрея. Все компоненты, кроме цистеина, NAD, сыворотки и пенициллина, сте­рилизуют автоклавированием при 121° С в течение 15 минут. Предвари­тельно в среду добавляют 1% агара Дифко.

Расплавленную агаровую среду охлаждают до 50° С и добавляют сте­рилизованные фильтрацией и подогретые до 50° С растворы термолабиль­ных компонентов (сыворотка, NAD, цистеин, пенициллин).

Модифицированная среда Хейфлик. Жидкая среда. Бакто PPLO-бульон (Difco) — 2,1 г в 70 мл Н₂0, сыворот­ка крови лошади — 20 мл, свежий дрожжевой экстракт — 8 мл, пенициллин 1000 ед/мл, дезоксирибонуклеиновая кислота (Sigma) —0,002%, ацетат тал­лия — 1:2000, устанавливают рН 7,6 -7,8, стерилизуют фильтрованием че­рез фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, разливают по пробиркам и хранят при 5° С. Можно добавлять глюкозу (0,5-1,0%) и феноловый красный (1:5000).
Агаровая среда. Бакто PPLO-arap (Difco) — 3,5 г в 70 мл Н₂0, сыворот­ка крови лошади — 20 мл, свежий дрожжевой экстракт — 8 мл, пеницил­лин G— 1000 ЕД/мл, ацетат таллия — 1:2000, устанавливают рН 7,2 -7,6. Агар стерилизуют в автоклаве, остальные компоненты стерилизуют фильтрацией, смешивают расплавленный агар (56° С) и остальные компо­ненты, разливают по чашкам Петри, хранят при 5° С. Жидкая питательная среда для M.hyosynoviae

PPLO-бульон с кристаллвиолетом (Difco) — 10,3 г; деионизированная вода — 470,0 мл. Среду стерилизуют и затем добавляют следующие сте­рильные ингредиенты: дрожжевой экстракт — 25,0 мл; пенициллин G (100 000 ед/мл) — 1,5 мл; таллия ацетат (5,6% раствор) — 1,2 мл; феноло­вый красный (0,5%-ный раствор) — 1,8 мл; аргинин-муциновая суспен­зия¹ — 16,0 мл; индюшиная сыворотка крови 129,0 мл. Устанавливают рН 7,2, хранят в замороженном виде.

Среда для гомогенизации материала при исследовании на свиные микоплазмозы. Модифицированный солевой раствор Хенкса (HBSS-A) —40 мл; HBSS-В — 40 мл; сердечно-мозговой экстракт (Difco) — 5,0 мл; PPLO-бульон с кристаллвиолетом — 5,2 г; деионизированная вода — 1170 мл. Стерилизу­ют текучим паром, т.к. при автоклавировании могут образовываться ток­сические продукты. Хранят при -40° С.

Состав HBSS-A: NaCl —80 г; КС1 — 4 г; MgS0₄ x 7H20 — 1 г; MgCl₂ x х 6Н₂0 — 1 г растворяют в 400 мл деионизированной воды, добавляют 1,4 г СаС1₂и воды до 500 мл, хранят при 4° С.

Состав HBSS-B: Растворяют Na₂HP0₄ х 12Н₂0 — 1,5 г в 400 мл деионизи­рованной воды, добавляют 0,6 г КН₂Р0₄ и воды до 500 мл. Хранят при 4° С. Бульон Friss. HBSS-A — 40 мл, HBSS-B — 40 мл, сердечно-мозговой эк­стракт (Difco) — 5 г, PPLO-бульон с кристаллвиолетом — 5,2 г, деионизиро­ванная вода — 1170 мл. После стерилизации охлаждают и добавляют следу­ющие стерильные компоненты: дрожжевой экстракт — 60 мл, бацитрацин (5 000 ед/мл) — 2,9 мл, метициллин (100 мг/мл) — 2,5 мл, феноловый крас­ный (0,5% раствор) — 4,5 мл, свиная сыворотка (инактивированная при 56° С 30 минут) — 165 мл, лошадиная сыворотка — 165 мл. Устанавливают рН 7,5 —7,6. Хранят при -40° С. Для выделения M.hyopneumoniae добавляют антисыворотку M.hyorhinis (5 мл/100 мл) и циклосерин (0,5 мг/мл).

Среда WJB (Lefevre P.C. et al., 1987). Бакто PPLO-бульон с кристаллвиолетом— 1,5 г, бакто-триптон (Difco) — 1,5 г, бакто-пептон (Difco) — 0,3 г, бакто-дрожжевой экстракт (Difco) — 0,1 г, деионизированая вода — 50 мл. Компоненты стерилизуют автоклавированием, затем добавляют ингредиенты, стерилизованные филь­трованием: ииактивированную сыворотку крови новорожденных телят — 45 мл, среду 199 (х 10) без NaHC0₃ с глутамином — 5 мл, свежий дрожже­вой экстракт — 5 мл, ДНК тимуса КРС (0,2%) —1,0 мл, глюкоза (50%) — 0,5 мл, NADH (10%) —
0,1 мл, ампициллин (100 мкг/мл) — 0,25 мл, ацетат таллия (10%) —
0,25 мл, феноловый красный (0,4%) — 1,5 мл. Устанавливают рН 7,6 —7,8. Для получения плотной среды добавляют 0,9% агарозы. Модифицированная среда Friss для выделения микоплазм мелкого ро­гатого скота (Friss N.F., 1974)

Раствор Хенкса (х10) — 3,0 мл, деионизированная вода — 72 мл, сер­дечно-мозговой экстракт (Difco) — 0,5 г, основной микоплазменный буль­он (BBL Microbiology Sistems) — 0,75 г, гидролизат лактоальбумина — 0,125 г, дрожжевой экстракт (Difco) — 0,05 г, феноловый красный (0,1%) — 1,37 мл. Стерилизуют автоклавированием, добавляют стерилизованные фильтрованием компоненты: свежий дрожжевой экстракт (25%) — 3,65 мл, [ глюкоза (50%) — 0,25 мл, ацетат таллия (2%) — 0,55 мл, лошадиная сыво­ротка —10 мл, инактивированная свиная сыворотка —
10 мл. Для получе­ния плотной среды добавляют 0,9% агарозы.

Модифицированная среда Хейфлик для выделения микоплазм мелкого рогатого скота. Бакто PPLO-бульон с кристаллвиолетом (Difco) — 2,1 г, деионизиро­ванная вода — 70 мл. Стерилизуют автоклавированием и добавляют ком­поненты, стерилизованные фильтрованием: инактивированная сыворотка новорожденных телят — 20 мл, свежий дрожжевой экстракт —10 мл, ДНК тимуса КРС (0,2%) —1,0 мл, ампициллин (10 мг/мл) — 0,25 мл, ацетат тал­лия (10%) — 0,25 мл, трифенил тетразолиум хлорид (2%) — 1,0 мл. Уста­навливают рН 7,6-7,8. Плотный вариант среды получают включением вместо бакто PPLO-бульона бакто-агара РРЮ.

Среда Ливингстона. 1 г PPLO-бульона (Difco) без кристаллвиолета растворяют в 70 мл дис­тиллированной воды, стерилизуют автоклавированием (121^е С, 15 минут), добавляют стерилизованные фильтрованием следующие компоненты: неинактивированную сыворотку крови лошади — 20 мл, дрожжевой экст­ракт —10 мл, раствор мочевины (10%) —10 мл, феноловый красный (1%) — 0,2 мл, пенициллин (100 000 ед/мл) — 1 мл. Устанавливают рН 6,04. Для получения плотного варианта среды добавляют 1% агар-агара № 2.

Среда Мартена. В 1л теплой (50° С) кипяченой водопроводной воды суспендируют 250 г фарша из свежих свиных желудков и добавляют
10 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь выдерживают 24 ч при 45-50° С, периодически по­мешивая. Прогревают 30 минут текучим паром и оставляют на 5 суток при 4° С. Надосадочную прозрачную жидкость декантируют, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют 30 минут при 120° С.

Модифицированная плотная среда ВИЭВ. К горячему 20%-ному агару на дистиллированной воде добавляют с-месь (поровну) среды Мартена и мясной воды с таким расчетом, чтобы по­лучить 1,5-2% концентрацию агара. Далее разливают в колбы и стерили­зуют 30 минут при 120° С. Перед использованием в расплавленный и осту­женный до 45-50° С агар добавляют 10% дрожжевого экстракта, 20% стерильной сыворотки крови лошади и 0,5% глюкозы.

Модифицированная жидкая среда ВИЭВ. Смешивают равные объемы среды Мартена и мясной воды, устанавли­вают рН 8-8,2 и стерилизуют 30 минут при 120° С. Перед использованием в среду добавляют 10% стерильного дрожжевого экстракта, 20% сыворот­ки крови лошади и 0,5% глюкозы.

Среда Эдварда. Смешивают 500 мл водопроводной воды и 10 г пептона. Устанавлива­ют рН 8,4. Стерилизуют 30 минут при 120° С. Перед использованием в среду асептически добавляют 20% инактивированной сыворотки крови ло­шади или крупного рогатого скота и 10% дрожжевого экстракта.

Для получения полужидкой или плотной среды Эдварда к жидкой среде добавляют соответственно 3 г или 20 г агар-агара.

Приготовление отвара сердечной мышцы. К 1 л дистиллированной воды добавляют 1 кг фарша из мышцы сердца крупного рогатого скота и остав­ляют на 16-18 часов, периодически перемешивая. Кипятят 40 минут, от­стаивают, надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр. Полученный отвар разливают в колбы и стерилизуют 30 минут при 120° С. Приготовление дрожжевого экстракта. В 200 мл дистиллированной воды суспендируют 50 г хлебных (пекарских) дрожжей, нагревают до заки­пания с пенообразованием. Охлаждают, после центрифугирования надоса­дочную жидкость стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца. Экст­ракт пригоден в течение 2 недель.

Среда Надь-Погани. В 1 л дистиллированной воды растворяют 2,5 г натрия хлорида, 0,075 г пептона, 2,5 г гидрофосфата натрия. Добавляют
1 мл 2,4%-ного вод­ного раствора фенолового красного. Устанавливают рН 8,0-8,2. Стери­лизуют 30 минут при 120° С. Перед использованием в среду асептически добавляют 200 мл дрожжевого экстракта и 200 мл стерильной сыворотки крови лошади.

Среда из гидролизата мышцы сердца крупного рогатого скота. Смешивают 1 часть фарша из мышцы сердца крупного рогатого скота с 1,5 частями дистиллированной воды, кипятят 10-15 минут. Остывшую массу пропускают через мясорубку, отстаивают. К 600 г отстоявшегося фарша добавляют 1 л полученного бульона. Устанавливают рН 8,0. Вно­сят 150 г измельченной свежей поджелудочной железы крупного рогатого скота и 30 мл хлороформа. Оставляют в закрытой бутыли в темном месте при 45-48° С на 10 суток. Периодически перемешивают. Надосадочную жидкость фильтруют через ватно-марлевый или полотняный фильтр. Уста­навливают рН 8,0. Добавляют 2% хлороформа и хранят при 4-8° С.

К 200 мл гидролизата сердечной мышцы добавляют 400 мл мясной воды, 400 мл дистиллированной воды, 5 г натрия хлорида. Устанавливают рН I 8,2. Прокипятив 15-20 минут, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют 30 минут при 120° С.

Среда Хофстад-Доерр. В 2 части дистиллированной воды вносят
1 часть фарша из мяса, сердца I и печени кур, перемешивают. Выдерживают 12 ч при 4-8° С, прогревают I на водяной бане (кипящей) 30 минут, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К фильтрату добавляют 0,5% натрия хлорида, 5% крови птиц. Устанавливают рН 7,8 и кипятят 30 минут на водяной бане, фильтруют, добавляют 0,5% мальтозы, 20% сыворотки крови птиц, ацетат таллия и пени­циллин до конечной концентрации 1:4000 и 100 ИЕ/мл соответственно. Стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца.