Биуретовая реакция

Качественные реакции на белки

Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по аминокислотным радикалам ее. Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция. Примером реакций второго типа являются многочисленные цветные реакции на радикалы аминокислот (реакция Сакагучи — с α-нафтолом, реакция Паули - с нитритом калия, реакция Циммермана — с о-фталевым диальдегидом, нингидриновая реакция и др.)

Биуретовая реакция.

К 1-2 мл раствора белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия и хорошо перемешивают. Затем из капельницы добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди и снова хорошо перемешивают. Развивается интенсивное красно - фиолетовое окрашивание, свидетельствующее о наличии пептидных, т.е. -СО-NH-, связей в молекуле белка. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.

Для сравнения проводят ту же реакцию с биуретом, который легко может быть получен при нагревании мочевины:

2 H₂N-CO-NH₂ → +t → NH₃ + H₂N-CO-NH-CO-NH₂

мочевина биурет

Для этого несколько кристаллов мочевины помещают в пробирку и осторожно прокаливают в пламени газовой горелки. По охлаждении приливают в пробирку 10%-ный раствор гидроксида натрия и добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди. После перемешивания развивается сине-фиолетовая окраска.

И в том, и в другом случае окраска вызвана образованием комплексного соединения:

Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп.

Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами полипептида.

Комплексы такого типа обладают преимущественно красной окраской (максимум поглощения в пределах 520-530 нм). В случае образования медных комплексов при участии трех или двух атомов азота окраска их преимущественно фиолетовая и синяя (с максимумами поглощения в пределах 540-580 нм и 615-670 нм соответственно). Поэтому окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой.