Глава 6. Инженерная энзимология

Ферменты и ферментативные системы традиционно применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других отраслях про­мышленности, в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе и т. д. Примеры использования ферментов в произ­водственной технологии приведены в табл. 6.1.

Таблица 6.1

Примеры использования ферментов в промышленности

В связи с расширением сфер использования ферментов накопи­лась определенная сумма знаний и опыт, которые послужили основой для формирования новой отрасли биотехнологии - инженерной энзимо- логии. Основная задача инженерной энзимологии - разработка биотех­нологических процессов, в которых используется каталитическое дей­ствие ферментов, выделенных из биологических систем или находя­щихся в составе клеток, лишенных способности расти. Из этого опреде­ления следует, что инженерная энзимология является прикладной дис­циплиной, которая имеет значительные перспективы в развитии произ­водственных технологий при реализации концепции устойчивого разви­тия общества.

Ферменты в качестве катализаторов химических превращений об­ладают многими преимуществами по сравнению с обычно используе­мыми катализаторами. Эти преимущества заключаются в следующем:

- эффективность ферментов как катализаторов значительно выше используемых в химической промышленности каталитических реаген­тов;

- ферментативные реакции протекают при физиологически при­емлемых температурах, что приводит к резкому снижению энергоемко­сти технологических процессов;

- высокая специфичность ферментов к субстратам и катализируе­мым реакциям значительно снижает расходы сырья и количество отхо­дов производства за счет отсутствия побочных продуктов.

Тем не менее развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной или полным отсутствием на мировом рын­ке нужных ферментов, особенно их чистых препаратов. Возможности применения ферментов осложнены еще по крайней мере двумя причи­нами:

- ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях, особенно тепловых;

- многократное использование ферментов затруднено из-за слож­ности их отделения от реагентов и продуктов реакции.

По этим причинам практическое использование ферментов могло быть ограничено, но уже на сегодняшний день найдены пути решения и этих проблем.

Принципиально новые перспективы открылись перед промыш­ленной энзимологией в результате создания иммобилизованных фер­ментов. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом преимуществ при использовании их в прикладных целях, по сравнению с нативными предшественниками.

Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакци­онной среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент ре­акцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например в проточ­ных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а так­же выход продукта путем изменения скорости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способ­ствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том чис­ле его специфичности, зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его ста­бильности по отношению к различного рода денатурирующим воздей­ствиям.

В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регу­лировать их каталитическую активность путем изменения свойств носи­теля под действием некоторых физических факторов, таких, как свет или звук.

В результате внедрения нового класса биоорганических катализа­торов - иммобилизованных ферментов - перед прикладной энзимологи- ей открылись новые, ранее недоступные пути развития. Следует отме­тить, что успех практического использования препаратов иммобилизо­ванных ферментов в значительной степени определяется подготови­тельным этапом работы - выбором подходящего носителя и метода им­мобилизации, а также знанием кинетико-термодинамических особенно­стей катализа иммобилизованными ферментами.

6.1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Под иммобилизацией понимают способы трансформации фермен­тов, обеспечивающие возможность их использования в непрерывных процессах. Иными словами, иммобилизация представляет собой вклю­чение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. Существуют два принципи­ально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (хи­мические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществ­ляется разными способами (см. рис. 6.1).

Методы иммобилизации ферментов

t

Химические

1 *

Для получения иммобилизованных ферментов используется огромное число носителей, как органических, так и неорганических. Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут быть применены для иммобилизации ферментов, следующие: а) высо­кая химическая и биологическая стойкость; б) высокая механическая прочность (в первую очередь по отношению к истиранию); в) достаточ­ная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная по­верхность, высокая вместимость, пористость; г) возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т. д.); д) легкое переведение в реакционноспособную форму (активация); е) высокая гидрофильность, обеспечивающая воз­можность проведения реакции связывания фермента с носителем в вод­ной среде; ж) невысокая стоимость. Отсутствие носителей, удовлетво­ряющих одновременно всем этим требованиям, и разнообразие задач, стоящих перед экспериментаторами, обусловливают широкий набор применяемых для иммобилизации материалов.

6.1.1. Физические методы иммобилизации

Методы иммобилизации, при которых фермент связывается с матрицей без образования ковалентных связей, называют физическими. Эти методы можно разделить на две основные группы - адсорбционные и методы механического включения фермента в матрицу. При адсорб­ционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхно­сти носителя с помощью электростатических, гидрофобных и водород­ных связей, а также дисперсионных взаимодействий. Механическое включение молекул фермента в матрицу предполагает использование поперечно сшитого геля, микрокапсул, волокон, мембран для ультра­
фильтрации и пр. Физические методы иммобилизации в большинстве случаев достаточно просты, быстры и эффективны, в последние годы они развиваются и используются очень широко.

Иммобилизация ферментов адсорбцией:

• На неорганических носителях

В настоящее время широко применяются материалы для носите­лей на основе кремнезема, окиси алюминия и титана. К преимуществам этих материалов можно отнести возможность широко варьировать по­ристость и структуру, а также достаточно сильную адсорбционную спо­собность по отношению к большинству белков.

Гранулированные носители такого рода очень удобны для коло­ночных реакторов различного типа.

Очень распространенный ранее носитель - уголь - в последние годы применялся в основном для ковалентной иммобилизации путем активации поверхностных оксидных групп.

Активированный уголь особенно удобен при работе с фермента­ми, катализирующими реакции с образованием Н₂О₂, поскольку этот носитель эффективно катализирует ее разложение.

В последнее время в качестве носителей для адсорбционной им­мобилизации ферментов все шире применяются минеральные соли, коллоидный кремний, металлы (никель, нержавеющая сталь) и окислы металлов.

• На органических носителях

Основной тип используемых в настоящее время органических но­сителей для адсорбционной иммобилизации - производные природных полисахаридов: целлюлозы и декстрана. В последнее время для адсорб­ционной иммобилизации ряда ферментов были использованы полиами- носахариды: хитин и хитозан. Эти носители эффективно связывают глюкоамилазу, глюкоизомеразу и химотрипсин. Недостатком этого ме­тода иммобилизации является легкая десорбция ферментов при «кис­лых» и «щелочных» значениях рН.

Широко также используются синтетические полимерные адсор­бенты - ионообменные смолы на основе фенолформальдегидных, эпок­сидных, полифенольных и полиакриловых матриц. Способ иммобили­зации прост - перемешивание раствора фермента и полимера при ком­натной температуре и высушивание.

• Сорбция ферментов на носителях смешанного типа

Носители смешанного типа получают нанесением липидных сло­ев (лецитина и холестерина) на твердую подложку (силикагель, сажу). Широко используется также возможность модификации неорганиче­ских адсорбентов-носителей, прививая к их поверхности органические соединения с определенными функциональными группами, например, аминируя их с помощью %-аминопропилтриэтоксисилана.