Животные in vivo и in vitro

В биотехнологии в качестве объектов при проведении фундаментальных научных исследований, а также в практических целях (терапия, фармакология, пищевая промышленность) используют животные организмы, а также культуры клеток животных, изолированные ткани и органы.

Культуры клеток животных служат главным образом для научных исследований. Так, культура клеток человека является объектом медико-биологических исследований при изучении клеточных, молекулярных, биохимических аспектов патогенеза целого ряда болезней, в том числе и наследственных; ее используют при исследовании возможностей применения и влияния лекарственных препаратов, БАВ, консервантов, косметических препаратов на морфологические и биохимические изменения в клетках. Для подобных исследований чаще всего применяют культуру фибробластов. Это связано с тем, что в 1978 г. А. Гринберг доказал адекватность результатов, полученных на культуре фибробластов, результатам, полученным на клетках целого организма. Кроме того, фибробласты служат главным клеточным элементом соединительной ткани, которая составляет значительную часть массы тела человека или животного.

Процессы клеточной дифференцировки и регуляции активности генов изучают в основном на культуре клеток беспозвоночных, так как они характеризуются большим разнообразием роста и метаморфозов. Эту же культуру применяют при выращивании вирусов в живых клетках насекомых для получения энтомопатогенных препаратов. В культурах клеток выращивают вирусы для их идентификации или для получения вакцин.

Клетки животных можно использовать для получения трансгенных особей, клонирования хозяйственно важных пород животных, гибридизации соматических клеток с целью получения химерных организмов.

В последнее время большое внимание уделяется эмбриональным стволовым клеткам. Это клетки, выделенные из эмбрионов на стадии бластоцисты, сохраняющие способность делиться в культуре in vitro, обладающие свойством плюрипотентности, т. е. способностью к дифференциров-ке в любые типы клеток животных.

На органных культурах изучают закономерности развития органов, способы сохранения их жизнеспособности перед трансплантацией. Целые организмы (трансгенные мыши) используют для моделирования ряда болезней человека и выявления механизмов их возникновения и протекания.

Практическое применение изолированных клеток, тканей, органов, целых животных организмов также весьма разнообразно. Клетки животных и человека служат в качестве продуцентов каких-либо веществ, например противовирусного препарата интерферона. Созданы перевиваемые культуры клеток животных, которые продуцируют моноклональные антитела, применяемые для диагностики заболеваний. Некоторые клетки животных и человека в культуре могут синтезировать биологически активные вещества: клетки гипофиза служат источником соматотропина (гормона — регулятора роста), липотропина (гормона — стимулятора расщепления жиров). В промышленности широко используют иммобилизованные ферменты, ферментативные комплексы и клетки животных. На клетках и тканях изучают влияние низких температур на сохранение жизнеспособности клеток, а также разрабатывают методы криоконсервации для расширения разнообразия клеток и тканей, которые можно сохранять в замороженном состоянии. В медицине культуру клеток кожи применяют для заместительной терапии при ожогах, а культуру клеток эндотелия — для реконструкции стенок сосудов. В практических целях в качестве естественных биореакторов лекарственных препаратов или пищевых белков предполагается использовать крупный рогатый скот, овец, свиней; однако в настоящее время введение генов, отвечающих за синтез необходимых соединений, сопровождается у трансгенных животных появлением тяжелых заболеваний и других негативных эффектов.

На рисунке представлена схема, отражающая многообразие объектов биотехнологии, диапазон их распространяется от организованных частиц (вирусов) до человека.

Схема объектов биотехнологии

В современной фармпромышленности используется очень широкий ассортимент биообъектов, группировка которых весьма сложна и наиболее рационально может быть выполнена на основе принципа их соразмерности. При этом биообъекты объединяют в пять основных групп.

К первой группе относятся биообъекты размером от 10 м до 1 см. К ним относятся: доноры (человек, корова, лошадь и другие животные); растения-бионакопители сапонинов, алкалоидов ит. п.; ядовитые животные и растения - донаторы ядов и др. Вторая группа включает биообъекты размером от 1 см до 1 мм. К ним относятся гигантские водоросли, продуценты альгинатов (загустители, радиопротекторы); каллусные культуры меристемы (продуценты панаксозидов, биотрансформаторы дигитоксина и др.); культуры тканей - дерма (искусственная кожа); культуры клеток - лейкоцитов, продуцентов интерферонов. В третью группу входят биообъекты размером от 1 мм до 1 мкм. Сюда относятся клетки эукариот в культуре; клетки низших эукариот (плесени, дрожжей) и прокариот в культуре. К четвертой группе относятся биообъекты размером от 1 мкм до 1 нм. К ним относятся бактериофаги и вирусы. В последнюю, пятую группу включают биообъекты размером менее 1 мкм - информационные макромолекулы (ДНК), макромолекулы с ферментативной активностью (ферменты-биокатализаторы, индивидуальные и мультиферментные комплексы), макромолекулы-носители (антитела и др.).

В настоящее время наибольшее число реализованных процессов имеют место в микробной биотехнологии. Это объясняется тем, что многие микроорганизмы обладают заметным преимуществом перед растительными и животными объектами по таким показателям, как скорость размножения, лабильность и быстрота адаптации к изменяющимся условиям среды обитания.

Важное значение в биотехнологии имеют макрообъекты, к которым относятся различные животные и человек. Так, для производства гомологичной иммунной плазмы (антистафилококковой, противосинегнойной), противокоревого гамма-глобулина (донорского и плацентарного), альбумина, плазмы, эритроцитарной и лейкоцитарной масс для трансфузий в роли биообъекта выступает человек-донор того или иного полупродукта. В случае производства иммунной плазмы человек выступает, кроме того, в качестве объекта иммунизации. В настоящее время в промышленном масштабе освоено выращивание лим-фобластов человека, продуцирующих интерфероны.

Крупные животные - лошадь, осел, мул являются объектами для иммунизации и одновременно продуцентами гетерологических антитоксических сывороток (противодифтерийной, противостолбнячной, противоботулинической, анти-эфа, антигюрза и др.). Кроме того, они являются донорами сыворотки и эритроцитов для производства холинэстеразы (для диагностики). Корова и як являются донаторами поджелудочной, паращитовидной желез, гипофиза, семенников, хрящей для производства препаратов из животного сырья: инсулина, панкреатина, паратиреоидина, тиреотропина, гиалуронидазы и румалона соответственно.

Свинья является донатором слизистой желудка для производства пепсина и поджелудочной железы - для производства инсулина. Марал (изюбр, пятнистый олень) является донором пантов, из которых получают пантокрин. Варан выступает в качестве донора нормальных эритроцитов для постановки реакции связывания комплемента (РСК), а также в качестве объекта иммунизации и продуцента различных диагностических сывороток. Коза в этой же роли выступает для получения гетерологической антисыворотки к вирусу клещевого энцефалита.

Для получения различных вакцин в качестве объектов для размножения вирусов используют органы и ткани, в том числе эмбриональные, различных животных: почки обезьян (вакцины против полиомиелита), почки морских свинок и фибробласты японских перепелок (противокоревая живая сухая вакцина), фибробласты куриного эмбриона (вакцина против клещевого энцефалита), мозговая ткань целостных организмов кроликов, крыс, овец (антирабические вакцины - для профилактики бешенства).

Необходимо отметить, что термином «донор» в данном случае обозначен биообъект, поставляющий материал для процесса производства лекарственного средства без ущерба для собственной жизнедеятельности, а термином «донатор» — биообъект, у которого забор материала для производства лекарственного средства оказывается несовместимым с продолжением жизнедеятельности.

Большое количество различных лекарственных средств в основе своего производства использует макроорганизмы из класса растений. Выращивание клеток высших растений возможно в виде нароста недифференцированной меристемы - каллуса - на поверхности твердой питательной среды или же в виде суспензии в жидких средах. Кроме того, клетки высших растений хорошо растут в монослое на твердых подложках или в суспензиях на поверхности плавающих (пористых) микроносителей.

Учитывая, что большое количество лекарственных препаратов, назначаемых в настоящее время, при лечении различных заболеваний, произведены на основе лекарственных растений, культивирование растительного материала в промышленных условиях имеет большое значение в качестве нового способа получения растительного сырья.

Преимуществом получения биомасс лекарственных растений в сравнении с использованием самих растений является, во-первых, возможность обеспечить за их счет стандартность накапливаемого сырья и сравнительно высокий выход целевых биологически активных веществ. Так, при производстве антиаритмического средства - аймалина, используя сухое растительное сырье, получают из 1 г 2,6 мг лекарственного вещества, а из 1 г лиофилизированной (высушенной) биомассы клеток меристемы - 13,0 мг. Во-вторых, это дает возможность сокращения срока культивирования. Вместо месяцев кропотливого труда по выращиванию лекарственных растений представляется возможность сократить и облегчить эти трудности. Каллусное и суспензионное культивирование клеток меристемы протекает в течение дней или часов. Наконец, в-третьих, культивирование позволяет получать в промышленных условиях и количествах биомассы тех растений, которые редко встречаются в природе или не произрастают в каких-то климатических поясах. Например, в нашей стране в этом плане особый интерес представляет выращивание в виде калусных или суспензионных культур раувольфии, диоскореи, унгернии и других растений.

Основным объектом биотехнологии являются микроорганизмы.

Известно несколько основных вариантов использования биообъектов из микромира при производстве лекарственных препаратов. Самый распространенный основан на получении биомассы с последующим ее использованием в качестве полупродукта или же готового продукта. Так готовят нормофлоры (колибактерин, бификол и др.), некоторые вакцины, лечебные и диагностические бактериофаги. Другой вариант предусматривает использование продуктов жизнедеятельности биообъектов, которые накапливаются в среде выращивания последних. На этом принципе основано производство ряда незаменимых аминокислот, витаминов, ферментов и антиферментов, антибиотиков, полисахаридов и др.

На основе биообъектов микробного происхождения производят различные микробные иммунобиологические препараты, к которым относят вакцины, диагностикумы, аллергены и бактериофаги.

Таким образом, среди соединений, продуцируемых микроорганизмами, можно назвать следующие: алкалоиды, аминокислоты, антибиотики, антиметаболиты, антиоксиданты, белки, витамины, коферменты, липиды, нуклеиновые кислоты и мн. др.

Любая клетка - целостная система, составные части которой структурно и функционально взаимосвязаны. Эта зависимость выражается прежде всего в генетически обусловленном синтезе белковых молекул - преимущественно ферментов. В настоящее время известно, что в мельчайшей клетке (0,1 мкм в диаметре), относящейся к Mollicutes, более 100 ферментов, т.е. столько, чтобы клетка могла самостоятельно функционировать как организм.

Ферменты - макромолекулы с ферментативной активностью давно являются объектами биотехнологии - их индустрия зародилась в начале XX в. Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом количестве, вирусам. Наука, изучающая ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимологшя - это ветвь биологической технологии, изучающая биотехнологические процессы, в которых используется действие ферментов. Главная задача инженерной энзимологии заключается в практической реализации ферментативных процессов в целях экономичного получения различных веществ и энергии для нужд народного хозяйства, в том числе для производства лекарственных средств.

С технологической точки зрения применение биообъектов - макромолекул с ферментативной активностью является перспективным в связи с тем, что они имеют ряд преимуществ перед химическими катализаторами:

· избирательность ферментов (только один тип реакции);

· стереоспецифичность действия ферментов (вступают в реакции с соединением определенной структуры);

· возможность протекания процессов в «мягких условиях»;

· протекание реакций с высокой скоростью при использовании незначительных количеств катализатора;

· отсутствие побочных реакций.

Способность микроорганизмов как носителей ферментов выступать в роли биологических катализаторов в настоящее время широко используется для синтеза промышленно важных стероидов (андростендиол, кортизон, преднизолон и др.); антибиотиков (пенициллин, ампициллин, рифамицин, цефалоспорин и др.); витаминов (А, Д, рибофлавина, кислоты аскорбиновой и др.) и других лекарственных средств.

Однако даже та обширная совокупность объектов, о которых сказано выше, не исчерпывает всей элементарной базы, которой оперирует биотехнология лекарственных средств. Это объясняется тем, что путем простого подбора не удается получить высокоактивные продуценты, поэтому возникает задача изменения природы организма (объекта) в нужном направлении. Для этого используют методы селекции и мутагенеза. С их помощью, например, получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность исходных штаммов в сотни и тысячи раз.

Селекция - это направленный выбор мутантов, т.е. организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотид-ной последовательности ДНК. Среди внешних воздействий, способных оказывать мутагенный эффект, используют лучи Рентгена, ультрафиолетовое излучение, некоторые химические соединения (например, нитрозопроизводные).

В последние 15-20 лет целенаправленное улучшение свойств живых систем как объектов биотехнологии резко ускорилось и расширилось после того, как с середины 70-х до середины 80-х гг. были разработаны методы генетической инженерии. Сначала это были методы рекомбинирования и конструирования выделенных генов из клеток различных биообъектов. На следующем этапе были усовершенствованы методы пере-^с носа генов в микроорганизмы, а в конце 70-х гг. отработаны подходы к переносу генов в культивируемые клетки животных.

В 1980-1982 гг. появились методы переноса генов в целые (многоклеточные) животные организмы и почти одновременно - методы переноса генов в растительные клетки и в целые растения. Микроорганизмы, а также клетки, растущие вне организма, после переноса в них новых генов называют генетически трансформированными клетками. Трансформированными можно называть и многоклеточные организмы - животных, растений, но чаще их обозначают как трансгенные животные и растения.

Генетический материал переносят в клетки и организмы с помощью различных методов. В микроорганизмы гены вводят в составе кольцевых молекул ДНК - плазмид, добавляя их в среду культивирования. В клетки животных гены вводят, либо добавляя их в среду культивирования, либо впрыскивая (микроинъекция) с помощью шприца и микропипетки.

Особые приемы используют для переноса генов в целые животные организмы. Один из них заключается в том, что очищенные гены впрыскивают в только что оплодотворившиеся клетки (зиготы) с помощью шприца и микропипетки, кончик которой (с внутренним диаметром 1 мкм) вводят непосредственно в ядро. Ген можно перенести в эмбрион и с помощью вирусов.

Существует два подхода переноса генов в растения. Первый состоит в том, что гены вводят в изолированные клетки, лишенные полисахаридных стенок (такие клетки называют протопластами). Затем из этих клеток получают целые растения. При другом подходе используют ДНК (Ti- плазмиду) микроорганизма Agrobacterium tumefaciens, способного заражать растительные клетки и переносить в них часть плазмиды вместе с любой содержащейся в ней чужой ДНК. Переносимый ген предварительно вводят в эту часть Ti-плазмиды.

Селекционные работы, проводимые на современном уровне, предусматривают использование каллусных или суспензионных культур клеток меристемы, что дает возможность прямого воздействия на геном продуцента (каллус — ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений на твердых питательных средах; культура клеток — выращивание отдельных клеток во взвешенном состоянии в жидкой среде).

В частности, производство аймалина (антиаритмическое средство) на основе меристемных культур Rauwolfia serpentina стало реальным, когда в ходе направленной селекции и отбора были получены клоны клеток (клон — культура, возникшая из одной клетки), синтезирующих этот алкалоид на порядок интенсивнее, чем исходные штаммы.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Перечислите основные виды объектов, используемые в технологии.

2. Расскажите о вирусах, их классификации и значении.

3. Какие клеточные структуры являются обязательными для бактерий?

4. Образование каких биотехнологических продуктов происходит с использованием бактерий?

5. Расскажите о классификации водорослей?

6. В чем отличие красных и зеленых водорослей?

7. Расскажите о планктонных и бентосных водорослях.

8. Какие виды водорослей используются в пищу?

9. Какие живые организмы относятся к лишайникам?

10. В чем выражаются особенности строения лишайников?

11. Какие продукты можно получать на основе лишайников?

12. На чем основана классификация основных отделов царства грибов? Перечислите их группы.

13. Приведите примеры продуктов грибного происхождения, получаемых методами биотехнологии.

14. Расскажите о водных растениях.

15. Перечислите возможности использования клеток высших растений в биотехнологии.

16. Что такое БАВ и какова их роль?

17. Расскажите о продуктах биотехнологии, получаемых из культур клеток и тканей высших растений.

18. Для каких целей используют культуры клеток животных?