Группы факторов патогенности (по функциям)

·1. адгезия (прикрепление: адгезины, капсулы, пили)

·2. инвазия (проникновение: жгутики, реже пили)

·3. токсинообразование (вызывают патоморфологические изменения различных органов и тканей)

·4. индукция цитокинов и медиаторов воспаления (приводит к иммунопатологии)

61. Факторы вирулентности м/о

Геномные острова патогенности

· сегменты бактериальной ДНК, несущие один или несколько генов вирулентности, приобретенные через мобильные генетические элементы: транспозоны, плазмиды или бактериофаги.

62. Адсорбция и адгезия бактерий – 1-й фактор патогенности

· Адсорбция – прикрепление к различным поверхностям в результате взаимодействия зарядов.

· Адсорбцию обусловливает отрицательный заряд на поверхности жизнеспособной бактериальной клетки.

· Чем больше гидрофобность клеточной поверхности, тем легче бактерия прилипает к субстрату.

· Адгезия - 1-й фактор патогенности начальный этап колонизации, определяющий весь дальнейший ход патологического процесса

· Адгезия – прикрепление за счет различных поверхностных структур: белков-адгезинов, рецепторов, капсулы, пилей.

· за счет белков-адгезинов и рецепторов - специфическое прикрепление.

· бактерии должны прикрепиться, прежде чем начнут развиваться в организме хозяина.

· после прикрепления они способны приступать к заселению и освоению ареала.

63. Движение бактерий – 2-й фактор патогенности

· Движение бактерий происходит за счет жгутиков.

· Жгутики - поверхностные структуры, обеспечивающие движение.

· Подвижность синонимом жизни – неотъемлемое свойство всего живого на Земле.

· Движение - проникновение (инвазия) в клетки и вглубь организма-хозяина.

· Инвазия - 2-й фактор патогенности.

· Возможность движения повышает конкурентноспособность микроорганизмов.

64. Понятие дисбиоценоза, пути коррекции

Дисбиоз (дисбактериоз) - качественное и количественное изменение состава нормальной микрофлоры макроорганизма.

Вследствие общего характера нарушений обменных процессов при дисбактероизе он играет определенную роль в развитии:

· онкологических заболеваний,

· гипертонической болезни,

· мочекаменной болезни,

· атеросклероза,

· нарушений свертываемости крови.

Пути коррекции (Пробиотики, Пребиотики, Симбиотики)

Иногда одновременно с антибактериальной терапией антибиотиками (особенно пенициллинами) или сульфаниламидами назначают антигрибковые антибиотики (например, Нистатин) с целью профилактики дисбактериоза, а также лечения кожного дисбактериоза, особенно при длительной антибактериальной терапии.

Как правило, одновременно с пре- и пробиотиками назначаются ферментные препараты, сорбенты (белый уголь, активированный уголь, Пепидол, полифепан и т. д.) и другие препараты — так как дисбактериоз не самостоятельное заболевание, а лишь часть других заболеваний, соответственно, необходима детоксикация организмаи лечение основного заболевания.

Вскармливание грудным молоком защищает детей от заболеваний, даже при наличии патогенных микроорганизмов в кишечнике.

65. Особенности колонизации м/о различных органов человека

Большинство патогенных бактерий проникают в организм через слизистую дыхательных путей, ЖКТ, мочеполовой системы или конъюнктиву. Кожа, особенно при стафилококковой инфекции, также может служить местом бактериальной колонизации, поэтому попадание бактерий на кожу чревато развитием заболевания.

Для успешной колонизации необходимо прикрепление бактерий к слизистой. Прикреплению способствуют многие поверхностные структуры бактерий, но чаще всего эту функцию выполняют фимбрии, капсульные полисахариды и липотейхоевые кислоты. Бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам слизистой или внедряются в слой слизи. В последнем случае колонизации препятствуют механизмы удаления слизи. Поэтому инфекциям дыхательных путей способствует цилиарная дискинезия или муковисцидоз, при котором часто происходит хроническое заражение Pseudomonas aeruginosa.

Теперь известно, что бактериальная клетка обладает множеством различающихся по серологическим свойствам факторов адгезии - адгезинов, причем на разных стадиях заражения участвуют различные адгезины.

Например, большинство штаммов Escherichia coli образуют фимбрии типа 1, прикрепление которых к тканям ингибируется D-маннозой. По- видимому, именно эти фимбрии способствуют прикреплению бактерий к слизистой.

Штаммы Escherichia coli, вызывающие пиелонефрит, имеют другой фактор адгезии - PAP (Pyelonephritis-Associated Pili - пиелонефрит- связанные фимбрии) или Р-фимбрии, которые обеспечивают связывание бактерий с остатками дигалактозы антигена P, определяющего группу крови системы P. Прикрепление в данном случае обусловлено добавочными субъединицами белков, расположенными на конце фимбрии. В опытах на яванских макаках мутантный штамм Escherichia coli (с точечной мутацией гена papG), у которого отсутствует концевой белок фимбрии, вызывал не пиелонефрит, а цистит.

Некоторые патогенные штаммы Escherichia coli прикрепляются к эпителию тонкой кишки с помощью так называемых факторов колонизации. К ним относят S- и G-фимбрии, а также группу адгезинов, которые связываются с комплемент-регулирующим фактором, защищающим клетки макроорганизма от разрушения комплементом (фактор ускорения распада, или CD55). Этот клеточный белок несет также эритроцитарный антиген Dr системы Кроумер.

Фимбрии Neisseria spp., Moraxella spp., Vibrio cholerae и Pseudomonas aeruginosa также принимают участие в прикреплении микроорганизмов к поверхности клеток. М-концевые участки у этих фимбрии сходны, а С-концевые - более разнообразны. У некоторых видов, например Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis, именно фимбрии обеспечивают прикрепление к эпителию слизистой, причем, как недавно показано, важную роль в этом процессе играет белок PilC. У других возбудителей, например Pseudomonas aeruginosa, фимбрии не столь важны для прикрепления к эпителию. В процессе прикрепления Vibrio cholerae к слизистой кишечника, очевидно, принимают участие два вида фимбрии.

Действенной мерой борьбы с инфекцией могло бы стать воздействие на процесс прикрепления бактерий, однако попытки создать эффективные вакцины, основанные на компонентах фимбрии, до настоящего времени не увенчались успехом. Сообщалось, что у свиней, телят и ягнят подобные вакцины предотвращают понос, вызванный Escherichia coli. Однако это не было подтверждено клиническими испытаниями, а клинические испытания гонококковой вакцины, основанной на компонентах фимбрии, оказались безуспешными. Одно из главных препятствий - различия серологических характеристик фимбрии.

В прикреплении возбудителя к поверхности клеток участвуют также обнаруженные у стафилококков особые белки, которые связываются с белками макроорганизма - фибрином, фибронектином, ламинином и коллагеном. Они были названы MSCRAMM (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules - микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные молекулы матрикса). Эти структуры, вероятно, способствуют прикреплению стафилококков к слизистой носа и к коже. Как оказалось, различные возбудители довольно часто прикрепляются к фибронектину. В этом процессе важную роль играет последовательность аминокислот Арг-Гли-Асп.

Прикреплению стрептококков к слизистой способствуют липотейхоевые кислоты, расположенные на поверхности бактериальной клетки. Полисахарид (альгинат) капсулоподобной оболочки Pseudomonas aeruginosa способствует прикреплению этой бактерии к муцину дыхательных путей.

Клиническое значение коагулазаотрицательных стафилококков определяется их способностью расти на протезах и катетерах. Прикреплению стафилококков к поверхности этих устройств способствует капсульный полисахарид.

66. Особенности постоянной и транзиторной микрофлоры человека

Постоянная нормальная микрофлора:

· она представлена несколькими видами, среди которых выделяют доминантные виды и виды-наполнители;

· преобладающими являются анаэробные бактерии (соотношение анаэробов к аэробам от 10: 1 до 100: 1);

· она образует биопленку;

· нормальная микрофлора достаточно стабильна.

Состав транзиторной микрофлоры может меняться в зависимости от:

· возраста,

· условий внешней среды,

· условий труда, рациона питания,

· перенесенных заболеваний,

· травм и стрессовых ситуаций.

67. Основные закономерности строения нормальной микрофлоры

Стерильные в норме ткани и органы здорового человека

· внутренние органы,

· головной и спинной мозг,

· альвеолы легких,

· внутреннее и среднее ухо,

· кровь, лимфа, спинномозговая жидкость,

· матка, почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре.

Наиболее богаты микроорганизмами:

· ротовая полость,

· толстый кишечник,

· верхние отделы дыхательной системы,

· наружные отделы мочеполовой системы и кожа,

· особенно ее волосистая часть.

68. Микрофлора тела здорового человека

Микробиота – это эволюционно сложившееся сообщество разнообразных микроорганизмов, населяющих открытые полости организма человека, определяющее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма.

Микробиоценоз

· Постоянная микрофлора

· Общая масса всех микроорганизмов составляет 3-5 кг, их насчитывается более 500 видов общим количеством 10¹⁴-10¹⁵ микробных клеток (в 100 раз больше собственных клеток организма человека).

· Транзиторная микрофлора (в норме - незначительное количество).

69. Функции микробиоты кишечника

· Фила Firmicutes состоит из 15 родов: Acetobacter, Bacillus, Сlostridium, Enterococcus, Eubacterium, Heliobacterium, Heliospirillum, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Mycoplasma, Spiroplasma, Sporomusa, Staphylococcus, Streptococcus.

· Фила Bacteroitedes включает 7 родов: Bacteroides, Porphyromonas, Chlorobium, Flavobacterium, Chlamydia, Prosthecobacter и Verrucomicrobium.

· Фила Actinobacteria также представлена 7 родами: Arthrobacter, Bifidobacterium, Corynebacterium, Frankia, Micrococcus, Mycobacterium и Propionibacterium.

Микрофлора двенадцатиперстной и тонкой кишки:

· молочнокислые бактерии (лактобактерии),

· бифидобактерии,

· бактероиды,

· энтерококки,

· в дистальных отделах тонкого кишечника появляются фекальные микроорганизмы, характерные для толстой кишки.

· КОЕ 10⁴-10⁵ в 1 мл содержимого

Функции:

· антагонистическая функция

· иммуногенная функция

· пищеварительная функция

· метаболическая функция участвует в обмене:

o белков,

o липидов,

o уратов,

o оксалатов,

o стероидных гормонов,

o холестерина;

· витаминообразующая функция

· детоксикационная функция

· регуляторная функция

70. Роль микрофлоры толстого кишечника

Анаэробы (до 96-98 %):

· бактероиды (особенно Bacteroides fragilis),

· анаэробные молочнокислые бактерии (например, Bifidobacterium),

· клостридии (Clostridium),

· анаэробные стрептококки,

· фузобактерии,

· эубактерии,

· вейлонеллы.

Аэробы и факультативные анаэробы (до 14%):

· грамотрицательные колиформные бактерии (прежде всего кишечная палочка),

· энтерококки,

· в небольшом количестве:

· стафилококки,

· протеи,

· псевдомонады,

· лактобациллы,

· грибы рода Candida,

· отдельные виды спирохет, микобактерий, микоплазм, простейших и вирусов.

71. Микрофлора ротовой полости

В зубных бляшках и гингивальной щели (десневом кармане) преобладают:

· бактероиды,

· вибрионы,

· фузобактерии,

· спирохеты.

Представителей нормальной микрофлоры полости рта можно разделить:

· количество бактерий измеряется в 10⁵-10⁸ КОЕ/мл. К этой категории относятся стрептококки, нейссерии, вейлонеллы;

· количество бактерий измеряется в 10³-10⁴ КОЕ/мл. К этой категории относятся стафилококки, лактобактерии, нитевидные бактерии;

· количество бактерий составляет в 10-10² КОЕ/мл. К этой категории относятся дрожжеподобные грибы

72. Микрофлора кожи

Особенно обильно заселены микроорганизмами те области кожных покровов, которые защищены от действия света и высыхания:

· подмышечные впадины,

· межпальцевые промежутки,

· паховые складки.

Нормальная микрофлора кожи Резидентная микрофлора кожи:

· Staphylococcus epidermidis,

· Staphylococcus aureus,

· Micrococcus spp.,

· Sarcina spp.,

· коринеформные бактерии,

· Propionibacterium spp.

Транзиторная микрофлора кожи

· Streptococcus spp.,

· Peptococcus spp.,

· Bacillus subtilis,

· Escherichia coli,

· Enterobacter spp.,

· Acinetobacter spp.,

· Lactobacillis spp.,

· Candida albicans и многие другие.

73. Понятие сукцессии, причины

Под биотопом принято понимать участок слизистой оболочки, кожи или орган макроорганизма с однотипными условиями существования микробных сообществ.
Cмена на определенном участке среды обитания одних сообществ другими называется микробной сукцессией.

В естественных (например, почвенных) микробных сообществах сукцессии обычно вызываются поступлением порции органического вещества той или иной формы. Поскольку различные микроорганизмы приспособлены либо к разрушению сложных полимеров, либо поглощению мономеров при их высокой концентрации, либо к существованию в условиях голода, по мере разрушения и использования органики происходят изменения в структуре сообщества.

В лесной подстилке, например, есть возможность изучать несколько стадий сукцессии одновременно, поскольку они сменяются при движении сверху вниз.

Помимо этого сукцессию могут вызывать изменения температуры, влажности, содержания газов или специфических веществ и т. п. Процесс почвообразования сопровождается продолжительной сукцессией как растительного, так и микробного сообщества.

74. Гетерогенность микробных популяций. Морфологические типы клеток микробных популяций

Критериями, позволяющими отнести бактерии к той или иной таксономической группе, являются:

· морфология микробных клеток (кокки, палочки, извитые);

· отношение к окраске по Граму (грамположительные и грамотрицательные бактерии);

· отношение к кислороду (аэробы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы);

· способность к образованию капсул и спор.

Морфологические типы клеток в популяции:

· морфологически интактные - физиологически активные клетки (делящиеся и неделящиеся) - электронно-прозрачные;

· покоящиеся клетки - электронно-плотные;

· деструктурированные клетки (частично или полностью автолизированные);

· инволюционные клетки (стареющие, утрачивающие свою морфологическую и физиологическую целостность).

Происхождение названия родов микроорганизмов

По морфологим или биохимическим особенностям клеток:

· Staphylococcus

· (гроздевидные кокки),

· Bifidobacterium

· (от лат. - разделённый надвое),

· Mycobacterium

· (грибовидные бактерии),

· Lactobacillus

· (от лат. lacto - содержу молоко).

По фамилии автора, открывшего данного возбудителя:

· Escherichia

· (Теодор Эшерих (Theodor Escherich) (1857 —1911) – австрийский ученый, педиатр),

· Klebsiella

· (КЛЕБС (Klebs) Элвин (1834-1913) – немецкий бактериолог),

· Neisseria

· (НЕЙССЕР (Neisser) Альберт Людвиг (1855-1916) - немецкий дерматовенеролог),

· Gardnerella

· (Гарднер (H. L. Gardner) амер. врач- гинеколог)

Происхождение названия видов микроорганизмов

По названию вызываемого данными микроорганизмами заболевания:

· Vibrio cholerae – холера;

· Shigella dysenteriae - дизентерия,

· Mycobacterium tuberculosis – туберкулез

По основному месту обитания:

· Escheriсhia coli- кишечник,

· Gardnerella vaginalis - вагина.

75. Иммуноферментный анализ

В основе иммунологических реакций лежит специфическое взаимодействие антигена с антителом.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

· При определении антигена - минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест-системой.

· При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Процент образцов, давших отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, действительно не содержащих выявляемый маркёр.

· Положительное прогнозируемое значение (ППЗ) – вероятность того, что пациент с положительным результатом анализа действительно болен (инфицирован).

· Отрицательное прогнозируемое значение (ОПЗ) – вероятность того, что пациент с отрицательным результатом анализа действительно здоров (не инфицирован).

Варианты иммунологических реакций:

· Прямые, основаны на взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация)

· Опосредованные реакции или непрямые, взаимодействие атнигена и антитела через посредника (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента)

· Реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флюоресцирующих антител).

76. Реакции агглютинации, разновидности и применение

Реакция агглютинации, варианты:

· Ориентировочная РА

· Развернутая РА

· Реакция Кастеллани

· РНГА

· РЛА

· Реакция Кумбса

· Ко-агглютинации

Реакция агглютинации (ориентировочная, для идентификации микроорганизма)

· Физ. р-р + культура микроорганизмов – отсутствие агглютинации

· Сыворотка (1:100) + культура микроорганизмов – наличие агглют.

Возможна спонтанная агглютинация – R-формы бактерий

Развернутая РА

метод Кастеллани (A. Castellani, р. 1878 г., итал. врач) — метод извлечения противобактериальных антител из иммунной сыворотки крови путем их сорбции на убитых бактериях соответствующего штамма (удаление АТ, реагирующих с групповыми АГ); применяется для изучения антигенных свойств бактерий, главным образом кишечной группы, а также для изготовления моноспецифических сывороток.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические антитела или антигены.

Отличается большей чувствительностью и специфичностью.

1. АГ (АТ) +эритроциты = нагруженные эритроциты

2. Нагруженные эритроциты + иммунная сыворотка или АГ

· Положительная Реакция (зонтик)

· Отрицательная Реакция (пуговка)

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

метод идентификации вирусов или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного.

в присутствии иммунной к вирусу сыворотки крови агглютинация эритроцитов отсутствует

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

• Частицы латекса (искусственные эритроциты) используют в качестве носителя АГ.

• Ревматоидный фактор - это аутоантитела анти-IgG (к Fc-фрагменту IgG), относящиеся к классу IgM. В сыворотке ревматоидный фактор обычно присутствует в виде комплекса с IgG. В высоком титре ревматоидный фактор выявляется в крови у 80% больных с тяжелым прогрессирующим ревматоидным артритом.

Реакция коагглютинации (РКА)

В качестве носителя используются:

¡ Белок А S.aureus (неспецифически адсорбирует на своей поверхности Fc-фрагменты иммуноглобулина G)

¡ Белок G стрептококков

¡ Инертные носители (активированный уголь)

Реакция Кумбса с неполными антителами (бруцеллез, резус-конфликт)

77. Реакции преципитации, разновидности и применение

Осаждение специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител

(в присутствии электролита)

Варианты:

· в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации

· в плотной среде в агаре (геле).

Разновидности:

· кольцепреципитации

Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

· реакция флокуляции

(по Рамону) (от лат. f1оecus - хлопья шерсти) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин - антитоксин или анатоксин - антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

· реакция преципитации в геле по Оухтерлони,

Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.

· радиальная иммунодиффузия по Манчини,

Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

· реакция иммуноэлектрофореза

сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммуннук сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте "встречи" с антигеном линии преципитации.

78. Реакции связывания комплемента

заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

79. Реакции иммунофлюоресценции

Различают три разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Прямая -флюорисцирующие АТ+исследуемый АГ

Непрямой – универсальная флюорисцирующая сыворотка + специфические АТ+исследуемый АГ

80. Этапы цикла амплификации при проведении ПЦР

(ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом
материале (пробе).

Этапы:

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.

81. Основные компоненты ПЦР, достоинства и недостатки метода

ПЦР: компоненты реакции

· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

· Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.

· Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

· Дезоксинуклеотидтрифосфаты (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК: dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

· Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

· Минеральное масло – предохраняет от испарения и разбрызгивания.

Направления генодиагностики (ПЦР):

· Медицинская диагностика (инфекционные заболевания, санитарно-показательные микроорганизмы в пищевых продуктах)

· Диагностика генетических и онко-заболеваний

· Судебная медицина и криминология (идентификация личности, установление отцовства)

Локализация возбудителей

ПЦР – прямой метод диагностики. Недоступность возбудителя ограничивает его диагностические возможности

· Нижние и верхние отделы мочеполовой системы (мазки, соскобы, моча, сперма, секрет простаты, биоптаты)

· Желудочно-кишечный тракт (биоптаты, желудочный сок, фекалии)

· Респираторный тракт (мазки, смывы, мокрота, БАЛ, плевральный выпот)

· Нервная система (СМЖ)

· Внутренние органы – печень, селезенка, лимфоузлы (кровь, биоптаты)

Локализация возбудителей и диагностическое значение ПЦР

· Цитомегаловирус - (кровь,клетки крови,биоптаты, СМЖ, соскобы, слюна, грудное молоко)

· Helicobacter pylori (биоптаты ЖКТ, зубной налет, фекалии)

· Папилломавирусы человека (эпителий слизистой, биоптаты слизистой)

· Трихомонады, гонококки, хламидии, гарднереллы, кандиды (соскоб УГТ, осадок мочи)

· Токсоплазма гондии (ликвор,кровь, АЖ)

· Шигеллы, салмонеллы (фекалии)

· Энтеровирусы (ликвор, фекалии, сточные воды)

Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики

· Контаминация пробы на стадии отбора материала

· Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР

· Отбор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры.

· Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы

· Потери ДНК во время пробоподготовки

· Контаминация в отдельных пробах

· Тотальная контаминация

Достоинства ПЦР – анализа:

· Высокая скорость

· Высокая производительность

· Высокая чувствительность и специфичность

· Эффективность в отношении диагностики медленно растущих и некультивируемых микроорганизмов

Недостатки ПЦР – анализа:

· Узкая направленность (нужно предполагать возбудителя).

· Проблема контаминации – строгий режим постановки.

· Наличие ингибиторов (гепарин при анализе крови).

· Не всегда подходит для контроля после лечения (Обнаруживают как живых, так и умерших м/о), не раньше, чем через 1 месяц.

82. Открытие вирусов, основы классификации

Вирусология -наука о вирусах (син. вирусные частицы, вирионы, вироспоры). Вирус – яд (с греч.)

· Вирусы- микроорганизмы, неклеточные формы жизни

Дмитрий Иосифович Ивановский

· 1892 – фильтрующийся вирус растений – вирус табачной мозаики

· 1896 -первый вирус человека и животных

o вирус ящура род Aphthovirus,

· сем. Picornaviridae.

Основные принципы организации вирусов:

· неклеточное строение

· отсутствие транскрипционно-трансляционного комплекса

· у вирусов нет органелл, ответственных за получение энергии

· всегда только один тип нуклеиновой кислоты: РНК или ДНК.

· неинтегральный способ репродукции

Самый крупный – вирус оспы Ø 300-450нм

Самый мелкий - вирус ящура Ø ~ 27 нм

Систематика вирусов

Царство вирусов разделено на семейства.

Названия сем. заканчиваются на: – viridae

сем. Picorna viridae

сем. Rhabdo viridae

Для вирусов человека и животных внутри семейства существует деление на рода.

Родовое название заканчивается: – virus

род Influenzа virus – вирус гриппа

род Aphtho virus – вирус ящура

Основы классификации вирусов

· в клетках любых живых организмах:

· прокариот (археев и бактерий)

· растений, водорослей, грибов

· животных и человека

· взаимодействуют с живыми организмами на разных уровнях:

o Клетка

o Орган

o Организм (м.б. весь)

o Популяция