Консервирующие (траспортные)-

предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов от момента взятия

биоматериала до посева для диагностики

Категории питательных сред по консистенции:

• Жидкие (бульоны) – изучение физиолого-биохимических особенностей и накопление биомассы микроорганизмов

• Полужидкие (1% агара) – хранение культур и культивирование анаэробов

• Плотные (3-5% агара)– выделение чистых культур, накопление, количественный учет, изучение культуральных свойств, антагонистические взаимоотношения

• Сыпучие – хранение посевного материала в промышленности (пшено, отруби)

• Сухие – выпускаются промышленностью для приготовления питательных сред

Транспортная система со средой Стюарта

• Среда Стюарта представляет собой полужидкий, бедный питательными веществами субстрат для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов, таких, как Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. и др. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде более суток, прочие – до нескольких дней.

• Наличие в среде тиогликолата подавляет ферментативную активность бактерий, а отсутствие азота предотвращает их размножение.

Транспортная система со средой Кери Блэйр

• Транспортная среда Кери Блейр представляет собой модификацию базовой транспортной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных образцов.

• Глицерофосфат, являющийся метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, и др.), заменен неорганическим фосфатом,

• удален метиленовый синий и рН среды увеличена до 8,4.

• Среда Кери Блейр позволяет сохранять большинство патогенов, включая требовательные микроорганизмы, такие как Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp.

• Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.

Транспортная система со средой Эймса

• Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модификацию базовой транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменен неорганическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ets.) и может поддерживать рост некоторых грамотрицательных микроорганизмов.

• Метиленовый синий заменен на активированный уголь фармацевтического качества.

• В среду добавлены кальций и магний для поддержания проницаемости бактериальных клеток.

• Эта среда способна более 3 дней поддерживать такие микроорганизмы, как Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebacteria, Streptococci, Enterobacteriaceae и др., однако наилучшие результаты дает культивирование в течение первых 24 часов.

Универсальные накопительные среды: Мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ)

• Являются основными средами для посевов микроорганизмов, для проверки чистоты культур перед биохимическим и серотипированием.

• Их используют для культивирования и подсчета неприхотливых микроорганизмов. В полужидком виде среда может быть использована для хранения контрольных (эталонных) микроорганизмов.

Универсальные накопительные среды Среда Хоттингера

• Предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки, некоторые виды стрептококков. При необходимости может быть обогащен углеводами, солями.

• Содержит гидролизат Хоттингера, который получают путём ферментативного гидролиза мясного фарша (говяжьего) панкреатином с последующим фильтрованием и добавлением хлороформа в качестве консерванта.

Универсальные накопительные среды: Среда Мюллера-Хинтона

• Эту среду используют для культивирования Neisseria sp. и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам.

Дифференциально-диагностические среды: Среда МакКонки

• Среды МакКонки в качестве дифференциальных рекомендуют для селективного выделения энтеробактерий и близких к ним грамотрицательных палочек.

• Лактозоположительные штаммы растут с образованием розовых или красных колоний, которые могут быть окружены зоной преципитации желчных солей.

• Красный цвет появляется в результате закисления среды продуктами разложения лактозы (при падении рН ниже 6,8) и адсорбции нейтрального красного.

• Штаммы, не ферментирующие лактозу (шигеллы, сальмонеллы), обычно образуют прозрачные бесцветные колонии и не изменяют среду.

Дифференциально-диагностические среды: Среда Эндо

• Эту среду рекомендуют для выделения и дифференциации грамотрицательных микроорганизмов кишечной группы.

• Эта среда разработана Endo как культуральная среда для дифференциации микроорганизмов, ферментирующих и неферментирующих лактозу. Она используется для микробиологического исследования воды, стоков, молочных и других пищевых продуктов.

• Сульфит натрия и основной фуксин обладают подавляющим эффектом на грамположительные микроорганизмы. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция очень выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.

Дифференциально-диагностические среды: Желточно-солевой агар

• Эту среду используют в качестве селективной для выделения клинически значимых культур стафилококков.

• Среда содержат протеозопептон и мясной экстракт, что делает ее очень питательной ввиду содержания необходимых ростовых факторов. Вместе с тем рост бактерий, кроме стафилококков, подавляется высокой концентрацией (7,5%) хлорида натрия.

• Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода.

• Добавление (до 5% об/об) эмульсии яичного желтка дает возможность определить липазную активность микроорганизмов. Эмульсия в солевой среде становится прозрачной, поэтому при наличии липазной активности вокруг колоний формируется желтая непрозрачная зона.

Дифференциально-диагностические среды: Вильсона-Блера или Висмут-сульфитный агар

• Селективная среда для выделения сальмонелл.

• Пептический перевар животной ткани и мясной экстракт служат источником азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста указанных бактерий.

• Бриллиантовый зеленый подавляет рост всех грамположительных бактерий. Глюкоза является ферментируемым углеводом. Сульфат железа позволяет выявить продукцию сероводорода.

• Висмут является тяжелым металлом, который подавляет рост большинства грамотрицательных кишечных бактерий, кроме сальмонелл.

• Сальмонеллы восстанавливают сульфат железа в присутствии глюкозы и сульфита висмута до сульфида железа, который окрашивает их колонии в черный цвет.

Специальные элективные среды: Среда Леффлера

• Эту среду с добавлением лошадиной сыворотки используют для культивирования Corynebacterium diphtheriae из клинического материала и пересевов чистых культур этих микроорганизмов.

• Высокая концентрация сыворотки помогает определить протеолитическую активность микроорганизмов, а также пигментообразование. Пептон и мясной экстракт обеспечивают микроорганизмы важнейшими питательными веществами. Глюкоза является ферментируемым субстратом и источником энергии.

Специальные селективные среды: Кампилобакагар

• Селективная среду для кампилобактерий которая состояла из основы кровяного агара с бараньей кровью или лошадиной кровью и антибиотиками.

• Антимикробные компоненты, существенно подавляют рост нормальной микрофлоры, способствуя росту и выделению из испражнений Campylobacter fetus ssp. jejuni.

• Присутствие амфотерицина В в добавке существенно или полностью подавляет рост грибов, введенный позже цефалотин усиливает подавление нормальной кишечной микрофлоры.

• Колонии Campylobacter fetus ssp. jejuni имеют слизистый характер, плоские серые с неправильными очертаниями или приподнятые, округлые, без гемолиза.

• Некоторые штаммы могут образовывать желто-коричневые или розоватые колонии.

• На влажной поверхности среды может наблюдаться слияние роста или роение

43. Культивирование м/о в лабораторных условиях

Культивирование - процесс выращивания м/о на питательных средах в определенных условиях, а развивающийся при этом организм называют культурой.

Рост - физиологический процесс в ходе которого увеличиваются размеры и масса оно популяции.

Рост культуры – не только рост одной клетки, но и общее увеличение числа клеток – биомассы, т.е. рост культуры м/о.

Способы культивирования: поверхностный/глубинный; периодический/непрерывный; в аэробных и анаэробных условиях.

Культивирование на поверхности жидких, плотных и сыпучих сред.

М/о кислород получают непосредственно из воздуха. При этом способе важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Н сыпучих средах поверхностным методом получают ферментные препараты. В жидких средах аэробные м/о часто растут, образуя на поверхности пленку. Этот способ используется и в лабораториях и в промышленности.

44. Особенности культивирования облигатных анаэробов

Методы культивирования анаэробных микроорганизмов

· Посев уколом анаэробных бактерий в столбик сахарного агара

· Изолированные по методу Вейнберга колонии анаэробов в сахарном агаре

Метод Виньял-Вейона

• в расплавленный и остуженный до 50°С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микроорганизмов — анаэробов

• Анаэростат предназначен для культивирования в чашках Петри микроорганизмов группы облигатных анаэробов и микроаэрофилов.

• Анаэростат представляет собой цилиндрическую емкость, герметично закрываемую с помощью ленточного замка. В крышку вмонтирован вакууметр и вентиль для присоединения вакуумного насоса и внешней системы источника газа.

• Создание анаэробной или микрофильной атмосферы для культивирования микроорганизмов в анаэростате может производиться двумя способами:

• • с помощью газогенерирующих пакетов типа Газпак;

• • вакуумзаместительным заполнением бескислородными газами (газовыми смесями).

Аппарат Киппа

• Для выращивания анаэробов в бескислородной среде можно использовать водородную атмосферу, образующуюся в аппарате Киппа действием серной кислоты на металлический цинк. Водород перед поступлением в сосуд с культурами проходит для удаления остатков кислотыты и О, через промывные склянки с 10 % раствором азотнокислого свинца и с щелочным раствором пирогаллола.

СРЕДА КИТТА-ТАРОЦЦИ

Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода.

Среда Вильсона — Блера

Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.

45. Рост и размножение бактерий. Факторы роста

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ НА ЖИДКИХ И ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ. ФАЗЫ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ

• Размножение бактерий определяется временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки.

• Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов.

• В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 мин у кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем, их колонии образуются через 18—20 ч, либо через 3—5 нед. соответственно.

Особенности микробного роста на жидких питательных средах

• Рост бактерий с равномерным помутнением среды.

• Придонный рост бактерий, характеризующийся образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой.

• Пристеночный рост бактерий, выражающийся в образовании рыхлых хлопьев, прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда.

• Поверхностный рост бактерий, характеризующийся появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки.

Факторы роста бактерий:

• аминокислоты,

• пуриновые и пиримидиновые основания,

• липиды,

• витамины,

• железопорфирины (гем)

• и другие соединения.

46. Метод получения чистых культур м/о

• Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.

• Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.

• Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.

Методы выделения чистых культур м/о

• Посев однократным истощающим штрихом

• Посев истощающим штрихом секторами

• Посев на скошенный агар, метод Шукевича

o Посев на скошенный агар применяют для накопления и хранения чистой культуры бактерий

o Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микроорганизмы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.

· Посев уколом

· Метод Дригальского

0,1мл материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

· Метод Коха (метод серийных разведений)

последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме.

· Метод мембранных фильтров

Этапы выделения чистой культуры микроорганизмов

I этап (нативный материал)

• Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).

• Посев на плотные питательные среды (получение колоний).

II этап (изолированные колонии)

• Изучение колоний (культуральные свойства бактерий).

• Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке

(морфологические свойства бактерий).

• Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры.

III этап (чистая культура)

• Определение культуральных, морфологических, биохимических

и других свойств для идентификации культуры бактерий

Выделение чистой культуры

Культуральные свойства:Характеристика колоний микроорганизма

Морфологическое и структурное разнообразие колоний:

1 — формы выпуклости колоний над поверхностью питательной среды; 2 — очертания колоний; 3 — характер края колоний; 4 — внутренняя структура колоний.

Форма колоний:

а – круглая; б – круглая с фестончатым краем;
в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем;
ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная;
л – концентрическая; м – сложная

Профиль колоний: а – изогнутый; б – кратерообразный; в – бугристый; г – врастающий в агар; д – плоский; е –выпуклый;ж – каплевидный; з - конусовидный

Край колоний: а - гладкий; б – волнистый; в – зубчатый;г – лопастный; д – неправильный; е – реснитчатый;ж – нитчатый; з – ворсинчатый; и - ветвистый

47. R- и S- типы колоний м/о

Своеобразной формой изменчивости является R-S-диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-ко лонии (англ. rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип - S-колоний (англ. smooth- гладкий)- имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т.е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые растут в R-форме.

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.

Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают после встраивания внехро-мосомных факторов наследственности, в том числе и умеренных фагов в бактериальную хромосому. Если эта мутация приводит к утрате генов, контролирующих образование детерминантных полисаха-ридных звеньев ЛПС у грамотрицательных бактерий, то образуются R-мутанты. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией соответствующими бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций.

Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке.

Вместе с тем S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например дизентерии Зонне, эшерихиоза, вызванного Е. coli О124 и др.

48. Особенности строения бактериальной колонии

Бактериальная колонизация – заселение ареала и образование микробного сообщества.

В лабораторных условиях колонизация - рост бактерий в виде колоний (отдельных округлых образований на плотных питательных средах (ППС).

В естественных условиях рост бактерий происходит в виде биопленок (рост на поверхности ППС).

По скорости своего размножения бактерии превосходят все другие организмы. В благоприятных условиях бактерии могут делится каждые 20 мин, образуя огромные по численности колонии.

При недостатке питательных веществ рост колонии бактерий останавливается. Многие бактерии при этом начинают образовывать споры, которые служат для сохранения особей, а не для размножения. Образуя спору, бактерия вырабатывает очень плотную оболочку. Споры предотвращают высыхание бактерии, способны переносить низкую или высокую температуры. Споры могут сохранять жизнеспособность сотни лет.

49. Особенности строение и функции бактериальной биопленки

В настоящее время признано, что большинство микроорганизмов в естественных и искусственно созданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ – биопленок.

· Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ

Этапы образования биопленки:

· Обратимая адгезия

· Необратимая (рецепторно - опосредованная) адгезия (экзополисахариды)

· Созревание биопленки

· экспрессия генов, отвечающих за синтез сигнальных молекул:

· Гр(+) - ацил-гомосериновые лактоны,

· Гр(-)- короткоцепочечные пептиды

· Состав матрикса: полисахариды микроорганизма и кислые полисахариды (муцин – продуцирует макроорганизм),

Феномен взаимодействия между бактериями получил название «quorum sensing или «чувство кворума