Создание повышенной концентрации углекислоты при культивировании посевов на чашках Петри и в пробирках

(рекомендуется при первичном выделении менингококков из ликвора, крови и получении биомассы).

Для создания повышенной концентрации С0₂ можно использовать любой сосуд с притертой крышкой, например, эксикатор. Засеянные чашки помещают внутрь сосуда вверх дном, там же укрепляют зажженную свечу высотой 2-3 см и закрывают крышкой, которой может служить и простое большое стекло. К моменту затухания свечи в сосуде создается повышенная концентрация С0₂ (7-10%). После этого сосуд с посевами помещают в термостат.

^ 14. Методические рекомендации по использованию реакции непрямой гемагглютинации для выявления антител при менингококковой инфекции.

1) Показания к проведению серологических исследований.

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами (Характеристика эритроцитарных менингококковых диагностикумов, выпускаемых производственным предприятием МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Минздрава РФ условия их хранения и техника постановки реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации подробно изложены в наставлении по применению диагностикумов, которое вложено в упаковку препаратов) серогрупп А. В и С проводят в следующих случаях:

а) как дополнительный метод диагностики, менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике (в начале заболевания, на 7 и 15 день болезни);

б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;

в) при проведении иммуноэпидемиологических исследований среди населения с целью определения соотношения серонегативных и серопозитивных контингентов;

г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами.

Реакцию непрямой гемагглютинации можно ставить как макро-, так и микрометодом, причем, в последнем случае используют только микротитраторы системы «Такачи».

Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.

Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1-2 часов при комнатной температуре.

При постановке РНГА можно использовать многоканальные пипетки с указанными объемами ингредиентов.

2) Необходимые реагенты и приборы:

- эритроцитарные менингококковые серогруппы А, В и С диагностикумы;

- сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические А, В и С (Входят в набор эритроцитарных менингококковых диагностикумов);

- нормальная кроличья сыворотка (Нормальную кроличью сыворотку получают от здоровых кроликов), сухая кроличья плазма или бычий сывороточный альбумин (Кроличья плазма и бычий сывороточный альбумин - коммерческие препараты);

- исследуемый материал (сыворотка крови человека);

- полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки или микротитраторы с V-образными лунками (системы «Такачи»);

- термостат для поддержания температуры 37°С;

- водяная баня для поддержания температуры 56°С;

- потенциометр для измерения рН растворов;

- пипетки стеклянные мерные;

- дозаторы пипеточные П1 на 0,5; 0,05;

хлорид натрия (NaCI);- натрий фосфорно-кислый двузамещенный (Na₂HPO₄x12H₂O);

- калий фосфорно-кислый однозамещенный (КН₂Р0₄);

- дистиллированная вода.

3) Подготовка ингредиентов.

- Приготовление исходного эабуференного физиологического раствора рН 7,2 (ЗФР).

В 0,5 л дистиллированной воды растворяют:

хлорида натрия (NaCI) - 8,65 г

натрия фосфорно-кислого

двузамещенного (Na₂HP0₄ • 12Н₂0) - 1,92 г

калия фосфорно-кислого

однозамещенного (КН₂Р0₄) - 0,44 г

Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой.

После растворения солей проверяют рН раствора, который должен быть равен 7.2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.

4) Стабилизирующий буфер.

В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный альбумин (БСА).

Используемая ИКС не должна давать неспецифической (спонтанной) реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Инактивированную при +56°С в течение 30 минут НКС или плазму добавляют к ЗФР из расчета 1,0 мл на 100,0 мл (получают 1% раствор), БСА не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0,5%.

5) Взятие крови.

Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики; при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.

После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +4°С. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.

Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток проводят в стабилизирующем буфере.

6) Учет реакции

Реакцию оценивают по общепринятой 4-х плюсовой системе (см. Наставление по применению эритроцитарных менингококковых диагностикумов).

За титр противоменингококковых антител принимают максимальное разведение сыворотки крови, в котором наблюдают четко выраженную агглютинацию эритроцитов с интенсивностью не менее чем на 2+, при условии, что в предыдущих лунках реакция шла на 4+ или 3+. Сыворотки крови с разведения 1:5 и выше с четко выраженной агглютинацией эритроцитов, оценивают как положительные.

7) Рекомендуемые сроки, кратность обследования и трактовка серологических результатов

При выборе оптимальных сроков и кратности обследования больных ГФМИ и для правильной трактовки серологических результатов необходимо принимать во внимание ряд факторов, влияющих на уровень антител: возраст больного, преморбидный фон, клиническую форму, тяжесть и период болезни:

сопутствующие заболевания, серологические особенности возбудителя. При менингококков ой инфекции, так же как и при других инфекционных заболеваниях, правильная оценка результатов серологических исследований может быть дана только при их сопоставлении с эпидемиологическими и клиническими данными.

Оптимальные сроки взятия крови у больного ГФМИ - первые дни болезни (1-3 день), вторая третья и последующие недели болезни. Первую сыворотку крови необходимо брать сразу же при поступлении больного в стационар, последующие через 7-10 дней.

8) РНГА при генерализованных формах менингококковой инфекции.

- РНГА с диагносттаумами А и С.

Антитела к группоспецифическим полисахаридам менингококков серогрупп А и С при ГФМИ можно выявить уже в первые дни болезни.Число серопозитивных лиц среди взрослых больных составляет в эти сроки около 40%. Максимальный уровень антител отмечается на 2-3 –ей неделях болезни, с 4-5 недели уровень антител постепенно снижается.

За условно-диагностический титр антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С у детей старше 3-х лет и взрослых принимают положительную реакцию в разведении сыворотки крови 1: 40 - 1:80, т.к. у лиц, не инфицированных менингококками в момент обследования, антитела в таких титрах встречаются сравнительно редко (9-11%).

У детей в возрасте до 1 года продукция антител выражена слабо, в связи с чем положительные реакции наблюдают обычно в более поздние сроки (со 2 недели болезни).

У детей моложе 3-х лет за условно-диагностический титр антител к полисахаридам А и С принимают положительную реакцию в разведении 1:20 и выше, т.к. при отсутствии менингококковой инфекции у детей этого возраста антитела или не обнаруживаются, или встречаются в единичных случаях в титрах не выше чем 1:5-1:10.

Интенсивность антителообразования не одинакова при различных клинических формах менингококковой инфекции. При менингококцемии и сочетанных формах (менингококцемия + менингит) уровень антител обычно выше, чем при других формах болезни.

При тяжелом течении ГФМИ и особенно при инфекционно-токсическом шоке противоменингококковые антитела обнаруживаются в низких титрах, а в отдельных случаях не выявляются вообще. При очень тяжелом течении болезни особенно при наличии тяжелых осложнений (отек и набухание мозга) антителообразование выражено слабо: в остром периоде болезни обнаруживают около 10% серопозитивных проб с низкими титрами (1:5-1:10). В дальнейшем, при улучшении состояния больных титры антител и число серо-позитивных проб может возрастать.

Обнаружение уже на 1 неделе болезни антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С в титре 1:160 и выше подтверждает менингококковую этиологию заболевания. В некоторых случаях такие титры антител, обнаруженные на 1 неделе болезни, могут сохраняться и в более поздние сроки заболевания. Хотя у данных больных не наблюдается сероконверсии, высокие показатели РНГА могут служить достаточным основанием для серологического подтверждения диагноза ГФМИ.

Диагноз ГФМИ определяется как этиологически подтвержденный при наличия динамики (четырехкратного и более) нарастания уровня антител. При двукратном нарастании титра антител - диагноз оценивается как подтвержденный лишь при выраженной клинической картине.

Число этиологически подтвержденных случаев ГФМИ методом РНГА может достигать: у взрослых 80%, у детей, в среднем 70% (в возрастной группе детей до 3-х лет - 60%, в старших возрастных группах -80%).

- РНГА с диагностикумом серогруппы В.

При интерпретации серологических данных, полученных при работе с эритроцитарным диагностикумом на основе полисахарида менингококков серогруппы В, необходимо учитывать следующие моменты.

Изучение иммуноструктуры населения с помощью РНГА с диагностикумом серогруппы В представляет определенные сложности из-за сходства химической структуры В-полисахарида менингококка и капсульного полисахарида Е.соli K1. Существует возможность наличия перекрестных реакций, что усложняет интерпретацию результатов относительно менингококка серогруппы В. Диагностикум может быть использован для подтверждения диагноза ГФМИ при исследовании сывороток крови в динамике, взятых в начале заболевания и через 2, 3 недели.

Генерализованные формы менингококковой инфекции, обусловленные менингококками серогруппы В, наиболее часто (до 60%) диагностируются у детей первых трех лет жизни, у которых антитело образование выражено слабо. При ГФМИ у взрослых, в большинстве случаев, в первые дни болезни уровень антител к менингококкам серогруппы В составляет 1:20-1:40, с последующей сероконверсией на 2-3 неделях. В отдельных случаях (14%) содержание антител на 2-3 неделях болезни может достигать титров 1:640 -1:1280 и выше.

- Групповая специфичность РНГА.

При постановке РНГА с набором эритроцитарных диагностикумов может выявляться одновременное присутствие антител к нескольким полисахаридам. В таких случаях серо-группу менингококков, вызвавших заболевание у данного больного, определяют по динамике нарастания уровня антител к одному из полисахаридов. При этом разница показателей парных сывороток должна быть не меньше чем на два разведения. При получении одинаковых титров антител к двум полисахаридам в условно-диагностических титрах, диагностируется ГФМИ без установления серогруппы возбудителя.

- РПГА при локализованных формах менингококковой инфекции (назофарингит и бактерионосительство).

При локализованных формах менингококковой инфекции серологические исследования не следует рассматривать как метод диагностики, поскольку вопрос о носительстве или менингококковом назофарингите решается на основании бактериологического обследования. Но в ряде случаев при проведении исследований в очагах ГФМИ серологические данные могут послужить дополнительным тестом, ретроспективно подтверждающим клинико-эпидемиологический диагноз менингококковой инфекции. При этом следует проводить обязательное исследование парных образцов сывороток крови, полученных с 10-14 дневным интервалом.

При назофарингите антителообразование более выражено, чем при бактерионосительстве. У больных назофарингитом менингококковой этиологии в 90% случаев выявляются противоменингококковые антитела, причем в 50% случаев с титрами от 1:40 и выше. Среди бактерионосителей независимо от серогруппы выделенного возбудителя специфические антитела определяют в 65% случаев, а с титрами от 1:40 и выше у 30% носителей.

В сыворотках крови, полученных от носителей, так же как и от больных (см. п.4.1.3.), могут выявляться антитела к нескольким полисахаридам менингококков. Нарастание антител к гомологичной серогруппе чаще отмечают при носительстве менингококков серогруппы А. В отдельных случаях динамика антител (сероконверсия) не позволяет серологически установить доминирующую серогруппу менингококков. В этом случае определяют носительство без установления серогруппы.

- РНГА при иммуно-эпидемиологических исследованиях.

Целью иммуно-эпидемиологических исследований является определение числа лиц вероятно восприимчивых к менингококковой инфекции и групп риска. Анализ проводят по числу серопозитивных и серонегативных лиц с учетом существующей эпидемической ситуации.

Например, в период эпидемического неблагополучия увеличивается число серопозитивных лиц и соответственно уменьшается число серонегативных к эпидемической серогруппе менингококков. В период спорадической заболеваемости, наоборот, растет число серонегативных лиц.

При проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения объем репрезентативных выборок устанавливается эпидемиологом в соответствии с численностью и возрастным составом коллектива, района, населенного пункта.

Определяемый фоновый уровень противоменингококковых антител связан с заболеваемостью менингококковой инфекцией на данной территории и уровнем носительства. Наиболее высокий уровень антител в разные эпидемические периоды определяют к менингококкам серогруппы В, что, возможно, отражает их серологическое родство с E.coli K1, моракселлой, непатогенными нейссериями. При этом число серопозитивных проб с титрами антител 1:20 и выше может достигать 90%.

К менингококкам серогруппы С уровень антител наименьший, число серо-позитивных сывороток с титром антител 1:20 и выше составляет 8%.

Уровень антител к менингококкам серогруппы А дает достаточно четкую характеристику эпидемиологической ситуации и отражает широту циркуляции возбудителя.

Анализ серологических результатов эпидемиологических исследований проводят на основании расчета следующих показателей:

а) процента серонегативных проб, полученных с каждым из эритроцитарных диагностикумов (А, В и С), который может отражать число вероятно восприимчивых лиц к менингококковой инфекции;

б) процента серопозитивных проб (все серопозитивные сыворотки крови, начиная с разведения 1:5 и выше), из числа которых выделяют пробы с титрами антител:

- в возрастной группе до 3-х лет с 1:10 и выше к полисахаридам А и С, с 1:20 и выше к полисахариду В;

- в старших возрастных группах детей и у взрослых с 1:20 и выше к полисахаридам А и С, с 1:80 и выше к полисахариду В. Процент сывороток крови с указанными выше уровнями антител отражает доминирующие на данной территории серогруппы менингококков.

- Применение РНГА для оценки эффективности вакцинопрофилактики менингококковой инфекции.

Формирование поствакцинального иммунитета носит группоспецифический характер. В связи с этим, в зависимости от используемой профилактики менингококковой вакцины, серологические исследования для оценки эффективности вакцинации проводят с применением РНГА с гомологичным эритроцитарным диагностикумом.

При вакцинации взрослых специфические противоменингококковые антитела к полисахариду А выявляют в высоких титрах (1:40 - 1:640 и выше) не менее чем у 80% привитых уже на 3-4 неделе после вакцинации. На протяжении последующих 6-8 месяцев у привитых титры антител несколько снижаются, но сохраняются на повышенном уровне не более двух лет.

medznate.ru

medznate.ru