Микроскопический метод

Световая микроскопия. Из исследуемого материала готовят препараты-отпечатки или препараты-мазки. Препараты окрашивают по Стемпу, Маккиавелло, Романовскому-Гимзе,по Маккиавелло в модификации Здродовского, по модифицированному методу Гименеж. В препаратах хламидии, располагаются отдельно или скоплениями внутри и вне клеток. При окраске по Стемпу хламидии ярко-красные, цитоплазма клеток бледно-зеленая, ядра клеток окрашены в бледно-зеленый цвет несколько интенсивнее, чем цитоплазма. При окраске по Маккиавелло хламидии приобретают рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток – светло-синяя, ядра – темно-синие, а по Романовскому-Гимзе – возбудитель хламидиоза окрашивается в темно-фиолетовый цвет, цитоплазма клеток фиолетово-голубая, ядра сине-фиолетовые.

Успех микроскопического исследования во многом зависит от качества приготовленных препаратов, возможностей и технического состояния светового микроскопа и опыта бактериолога. Для работы необходимо использовать микроскопы с высоким разрешением (0,14 – 0,2 мкм) и общим увеличением в 1350 – 2000 раз.

Люминесцентная микроскопия. Для индикации хламидий в исследуемом материале используют метод флуорохромирования. Техника окраски: препараты (мазки) фиксируют жидкостью Корнуа в течение 5 мин; двукратно отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 — 4 мин; наносят рабочий раствор акридинового оранжевого на 10 — 20 мин; трижды отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 мин и больше; заключают в этот буфер, прикрепляя покровное стекло парафином.

Исследуют в люминесцентном микроскопе (лучше в падающем свете) с комбинацией фильтров СЗС, БС, ФС.

Элементарные тельца хламидий флуоресцируют ярко-зеленым светом, их промежуточные формы — от соломенно-темного до оранжевого свечения. Подобные структуры обнаруживают, как внутри, так и вне клеток.

Метод дает хорошие результаты при исследовании мазков из патологического материала, особенно плодовых оболочек абортировавших животных (см. приложение 2).

Идентификация хламидий проводится с помощью реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Используют прямой и непрямой варианты.

Для приготовления препаратов используют стекла с матовой площадкой у края и надписи ведут простым карандашом.

Прямой метод иммунофлуоресценции. Фиксированные холодным ацетоном препараты после промывания ФСБР обрабатывают синькой Эванса 30-40 с, промывают водопроводной водой.

При отсутствии синьки Эванса препараты обрабатывают смесью в равных объемах, состоящей из флуоресцирующей хламидийной сыворотки (содержит антитела против хламидий, меченые ФИТЦ) и бычьего альбумина, меченного родамином, взятого в удвоенном титре.

В случае применения синьки Эванса препараты обрабатывают только меченой флуоресцирующей хламидийной сывороткой (в термостате при +37°С в течение 30-40 мин во влажной камере). Тщательно промывают ФСБР, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой вариант реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Готовят следующие растворы: фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) —6,8 г NаС1, 0,63 г КН₂РО₄ и 1,48 г Nа₂НРО₄ последовательно растворяют в 1 л дистиллированной воды рН 7,2; забуференный глицерин - смешивают одну часть ФСБР с девятью частями глицерина; раствор синьки Эванса: 1 г синьки растворяют в 100 мл дистиллированной воды во флаконе из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора красителя (1: 10000) берут 0,1 мл раствора 1: 100 и объем доводят дистиллированной водой до 10 мл.

Техника окраски: мазки из патологического материала, инфицированных клеточных культур и т. п. фиксируют ацетоном на холоде в течение 5—10 мин, промывают ФСБР и подсушивают на воздухе. Для устранения неспецифической люминесценции фона на мазки на 30- 40 с наносят рабочий раствор синьки Эванса (1: 10000), которую смывают слабой струей водопроводной воды. Наносят на каждый препарат 1-2 капли кроличьей (или другого вида животного) иммунной антихламидийной сыворотки, содержащей обычные немеченные антитела против хламидий в титре не ниже 1:32-1:64. Препарат помещают во влажную камеру и помещают в термостат при температуре - 37°С на 30-40 мин.

Затем тщательно промывают ФСБР три раза по 5—10 мин; на препараты наносят антивидовую (содержащую меченые ФИТЦ антитела против глобулинов того вида животного, с использованием которого получена первая иммунная сыворотка) сыворотку, выдерживают в термостате при температуре +37°С во влажной камере 30-40 минут. Тщательно промывают ФСБР. На каждый препарат наносят по капле забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, которое прикрепляют расплавленным парафином. Препараты исследуют под люминесцентным микроскопом в падающем свете при комбинации светофильтров ФС 1-2, БС-8-2, СЗС 7-2 и запирающем ЖС 18, объектив иммерсионный.

Препараты, обработанные синькой Эванса, в ультрафиолетовых или сине-фиолетовых лучах, имеют красный фон разных оттенков, тогда как элементарные тельца хламидий, их колонии (включения) флуоресцируют зеленым изумрудным светом.

При отсутствии синьки Эванса можно использовать для контрастирования фона бычий альбумин, меченный родамином, который в удвоенном титре смешивают с первой сывороткой 1:1.

Бычий альбумин уступает синьке Эванса в том смысле, что каждый раз дополнительно необходимо определять его рабочую дозу методом титрации.

Фон препаратов, обработанных меченым бычьим альбумином, оранжевый, хламидийные структуры — изумрудно-зеленые.

Контроли: первый тест блокировки — после обработки препарата обычной иммунной (немеченой) хламидийной антисывороткой, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна вызвать свечения хламидиозного антигена (элементарных телец, промежуточных форм хламидий или их включений);

второй тест нейтрализации — после инкубации со специфическим (хламидийным) антигеном, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна давать заметного окрашивания хламидийного антигена;

третий — нормальная, не иммунная меченная ФИТЦ сыворотка того же вида животного, продуцента иммунной хламидийной антисыворотки, не должна окрашивать хламидийный антиген;

четвертый — в контрольных препаратах, приготовленных из тканей заведомо здоровых животных, флуоресцирующая хламидийная антисыворотка не должна окрашивать цитоплазму клеток.