Апоптоз — программируемая гибель клетки

Апоптоз — фрагментация содержимого клетки изнутри, осуществляемая специальными внутриклеточными ферментами, индукция и активация которых происходит при получении клеткой внешнего сигнала или при принудительной «инъекции» в клетку ферментов–активаторов апоптозной «машины» (последнее имеет место при осуществлении эффекторной функции ЦТЛ при убийстве ими клеток–мишеней). Апоптоз развивается и при повреждении клетки внешними факторами, не приводящими к некрозу, но способными инициировать апоптоз (ионизирующая радиация, обратимый перегрев и др.).

Явление одновременной гибели определённых клеток в многоклеточном организме наблюдали ещё в конце прошлого века — начале нашего и именно на лимфоцитах. Физиологи регистрировали, что при голодании в первую очередь организм теряет значительную часть лимфоцитов. Поскольку функции лимфоцитов в те времена были неизвестны, их даже называли трофоцитами как раз за то, что организм «съедает» их в первую очередь при голодании. Наблюдали также безвоспалительную гибель тимоцитов при введении в организм экспериментальных мышей глюкокортикоидных гормонов. Термин «апоптоз» тогда ещё не применяли.

Апоптозом более 20 лет назад назвали биологическое явление, описанное при гистологическом исследовании развития личинок круглых червей — почвенной нематоды Caenorhabditis elegans. У червей наблюдали одновременную гибель одного и того же числа клеток в строго определённый момент развития: тело личинки содержит 1076 клеток, а тело взрослой нематоды — 945, и ровно 131 клетка в нужный момент исчезает. Эта «ровность» навела на правильную мысль о запрограммированности такой клеточной смерти.

Термин «апоптоз» происходит от греческого apoptosis — листопад. У нематод идентифицировали два гена — ced–3 и ced–4, необходимые для осуществления апоптоза, и один ген ced–9, подавляющий апоптоз. В 1976 г. были опубликованы результаты биохимических экспериментов, в которых при электрофорезе ДНК обнаружили факт фрагментации ДНК на регулярные отрезки размером примерно 180 пар нуклеотидов. Как всякая регулярность и правильность, а не хаос это также навело на верную мысль о том, что в данном случае учёные столкнулись с закономерным явлением природы, имеющим отлаженный биохимический и клеточный механизм развития. Но с феноменом запрограммированной гибели клеток этот факт был «увязан» позже. У млекопитающих клетки всякой ткани, которой свойственна пожизненная физиологическая регенерация, в дифференцировке устанавливают программу на апоптоз.

Примеры морфогенетических событий, при которых происходит апоптоз, как минимум следующие:

· удаление стадиоспецифичных тканей и органов в эмбриогенезе;

· удаление короткоживущих (несколько часов) клеток крови (например, нейтрофилов);

· позитивная и негативная селекция тимоцитов;

· элиминация пролиферирующих клеток в отсутствие их специфических факторов роста;

· индуцированная активацией смерть лимфоцитов.

Но вообще говоря, во всякой живой ткани есть какое-то количество клеток, претерпевающих апоптоз, ибо все ткани с той или иной скоростью обновляются, пока организм жив. Кроме того, апоптоз запускается в клетках–мишенях при работе таких эффекторов иммунитета, как ЦТЛ и NK, в том числе как эффекторы антителозависимой клеточной цитотоксичности.

У периферических лимфоцитов есть три Рц и три сигнала на апоптоз — Fas–FasL, TNFR1–TNF, Рц для глюкокортикоидов–глюкокортикоиды. Экспрессия этих Рц инициируется вместе с началом иммунного ответа и нарастает по мере активации и дифференцировки иммунных лимфоцитов. Всего же в иммунной системе не только в периферических тканях, но и при лимфопоэзе известны следующие пары Рц—лиганд, связывание которых индуцирует апоптоз в клетке — носителе Рц:

· Рц Fas (CD95) на клетке–мишени — Fas–лиганд (FasL) на мембране клетки–"убийцы», Рц Fas относится к семейству Рц для TNF;

· Рц для глюкокортикоидных гормонов в лимфоците — глюкокортикоидные гормоны. Образование этого комплекса как механизма индукции апоптоза «работает» на территории тимуса при позитивной селекции, причём глюкокортикоиды синтезируются эпителиальными клетками тимуса. На территории тимуса при негативной селекции тимоцитов апоптоз индуцирует Fas–лиганд, экспрессированный на дендритных клетках тимуса. Вероятно, глюкокортикоиды индуцируют апоптоз и активированных лимфоцитов в периферических тканях;

· при определённых сопутствующих условиях Рц для фактора некроза опухоли — TNF типа 1 (TNFR–1, p55) и его многочисленные лиганды (например, TNFa). В настоящее время выделяют до 6 так называемых Рц TRAIL (TNF–receptor–related apoptosis inducing ligand), родственных Рц для TNF, лиганды которых могут вызывать апоптоз;

· CD30 (на тимоцитах или T–лимфоцитах) — CD30L (на эпителии и дендритные клетки мозговой зоны тимуса и других клетках).

После связывания с лигандом Рц Fas тримеризуются. В цитоплазматических участках Рц Fas и TNFR–1 есть особые «домены смерти», обеспечивающие белок–белковое взаимодействие с адапторными белками FADD (связывается с Fas–Рц изнутри клетки) и TRADD (связывается с TNFR–1). Эти адапторные белки связывают особый фермент — цистеиновую протеазу каспазу–8. C–концевой участок этой молекулы является прокаспазой. Каким-то образом в начало апоптозного процесса вовлекаются митохондрии: повышается проницаемость их мембраны и из митохондрий в цитозоль высвобождается цитохром С. В цитозоле цитохром С образует комплекс с белком Apaf–1. Этот комплекс активирует каспазы, в первую очередь каспазу–8. Каспаза–8 запускает каскад активации других каспаз, последняя из которых (возможно, каспаза–3) активирует особую ДНКазу CAD. Эта ДНКаза разрезает ДНК клетки между нуклеосомами на куски размером примерно по 200 (50–300) пар нуклеотидов.

Каспазы — (относящиеся к апоптозу цистеиновые протеазы CASP) аспартатспецифические протеазы, ключевые ферменты воспаления и апоптоза, осуществляют деградацию множества клеточных белков, функционируют во внутриклеточных сигнальных путях на промежуточных и завершающих стадиях реализации апоптоза. В апоптозе участвуют два класса каспаз — инициаторы и эффекторы. Проапоптозным сигналом активируются инициаторные каспазы ‑2, –8, –9). Инициаторные каспазы процессируют эффекторные каспазы ‑3, –6, –7), действие которых и приводит к гибели клетки вследствие расщепления специфических субстратов, в первую очередь ферментов метаболизма нуклеиновых кислот (например, поли[АДФ-рибоза] полимераза, КФ 2.4.2.30).

Номенклатура каспаз. У человека известно 11 каспаз семейства ICE/CED–3 (ICE — от Interleukin 1b Converting Enzyme [каспаза 1], КФ 3.4.22.36; CED–3 — от CEll Death gene ced–3 почвенной нематоды Caenorhabditis elegans). Для членов этого семейства предложено тривиальное имя «каспаза» — «caspase» («c» от «cysteine»), «aspase» от «asp» («aspartic acid» — расщепление полипептида после остатка аспарагиновой кислоты). Для обозначения отдельных каспаз добавляется номер фермента (каспаза 1, каспаза 2,..., каспаза 13).

Параллельно и, по-видимому, независимо от фрагментации ДНК наступает фрагментация остального содержимого клетки (рушится цитоскелет), и клетка сначала сморщивается и уменьшается в размерах, затем распадается на апоптозные пузырьки, или тельца. При этом внутриклеточное содержимое почти не вытекает во внеклеточную среду и в окружающей ткани не развивается воспаление. Поэтому тимус, в котором больше 95% тимоцитов, непрерывно погибает апоптозом, не болит, не отекает, не краснеет, не повышается его температура.

Каспазы связаны с кислыми и нейтральными сфингомиелиназами, которые, будучи активированными, генерируют церамиды и ганглиозиды, меняющие мембраны клетки. В результате ядро постепенно сморщивается и фрагментируется. Клеточная мембрана теряет упругость, местами происходит инверсия фосфолипидов и наружу «выворачивается» фосфатидилсерин. Его способны распознавать макрофаги и дендритные клетки (ДК). Затем клетка распадается на окружённые мембраной фрагменты — апоптозные тельца. Внутриклеточное содержимое при этом не «вытекает» во внеклеточную среду. Воспалительная реакция в ткани не развивается. Апоптозные тельца — мембранные пузырьки — фагоцитируют макрофаги либо поглощают ДК макроэндоцитозом. Макрофаги сорбируют апоптозные тельца следующими молекулами своей мембраны: интегрином avb₃ молекулой CD36 (молекула адгезии, GPIIIb), Рц для «мусора» (scavenger receptor). ДК сорбируют апоптозные тельца интегрином avb₃ и молекулой CD36.

Макрофаги разрушают вещество апоптозных телец до мелких метаболитов. При этом не активируется продукция провоспалительных цитокинов в макрофагах. А вот дендритные клетки перерабатывают вещества апоптозных телец, как и любых других Аг, и в результате экспрессируют на мембране комплексы пептидов с молекулами MHC–I и II. Среди пептидов находятся как экзогенные, например, вирусные (если апоптозу подверглась инфицированная вирусом клетка), так и пептиды — фрагменты собственных белков организма. Дендритные клетки способны индуцировать иммунный ответ на компоненты апоптозных телец. Именно такие процессы лежат в основе развития иммунного ответа на собственные повреждённые ткани, а также на тканевые Аг чужеродных трансплантатов.

Известны гены (по крайней мере два), продукты которых предотвращают апоптоз. Это гены Bcl–2 (соответственно белок bcl–2) и Bcl–x. Ген Bcl–2 млекопитающих гомологичен гену ced–9 у нематод. С гена Bcl–x в результате альтернативного сплайсинга первичного РНК–транскрипта получаются два белка — малый (small) bcl-x_S и большой (large) bcl_L. Белок bcl–x_S индуцирует апоптоз, а белок bcl_L апоптоз предотвращает. Механизм антиапоптозного действия белка bcl–2 предположительно известен: этот белок связывается с мембраной митохондрий и препятствует высвобождению из этих органелл цитохрома С, без чего апоптоз не начинается. Излишняя экспрессия этих антиапоптозных белков происходит при лимфопролиферативных заболеваниях и хронических воспалительных процессах, например при ревматоидном артрите в T–лимфоцитах синовиальных полостей. В последнем случае полагают, что антиапоптозные сигналы лимфоциты синовиальных полостей получают от разросшихся фибробластов стромы, что в патогенезе заболевания является первичным процессом по отношению к патогенетическим эффектам активированных T–лимфоцитов.

Сигналы для экспрессии Bcl–2 и Bcl–x_L, вероятно, приходят с g–цепи Рц для цитокинов, общей у Рц для интерлейкинов 2, 15, 4, 7 и 13. Кроме того, при анализе механизмов хронического воспаления суставов при ревматоидном артрите установили, что индукция антиапоптозных генов в зрелых T–лимфоцитах (которым в норме положено было бы умереть апоптозом), вероятно, происходит при взаимодействии молекул интегринов на фибробластах (активный пептид Arg–Gly–Asp–Ser) с молекулой LFA–1 (CD11a/CD18) на T–лимфоцитах.

Кстати, в экспериментах с B–лимфоцитами показано, что активация B–лимфоцита через специфический Рц для Аг (BCR) сопряжена с защитой от апоптоза на несколько дней, необходимых для развития иммунного ответа, тогда как стимуляция B–лимфоцита, помимо BCR, например митогенами, приводит к их быстрому, опосредованному через Fas–Рц апоптозу.

Индукция так называемой высокодозовой толерантности (когда в организм парентерально вводят большую дозу специфического Аг) по механизму — это элиминация Аг–специфичного клона лимфоцитов апоптозом как следствие «ударной» активации клона специфическим Аг. Превышение меры — всегда патология.

В норме факторы транскрипции, образующиеся при нормальном ходе активации T–лимфоцита, — АP–1, NFAT, NFkB — активируют и энхансерные последовательности для Fas–лиганда, что создаёт перспективу для апоптоза лимфоцитам, «отработавшим» в иммунном ответе.

Суперантигены индуцируют апоптоз сразу после пролиферации поликлонально «охваченных» T–лимфоцитов, они также индуцируют апоптоз дендритных клеток. Все перечисленное объясняет продолжительную иммунодепрессию после воздействия на организм суперантигенов.

Описаны наследственные дефекты в Fas или/и FasL: такие люди с самого рождения страдают тяжёлыми формами лимфо-пролиферативных или/и аутоиммунных болезней, быстро приводящих к смерти.

У млекопитающих выявлены и другие гены, кодирующие продукты подавления апоптоза: Bcl–w, Mcl–1, ALG–3 и др. Гены, ингибирующие апоптоз «наших» клеток, найдены у вирусов Эпштейна–Барр, аденовирусов, вируса африканской лихорадки свиней. Наличие таких генов у вирусов положительно коррелирует с их онкогенностью. Поэтому не напрасно клиницисты рассматривают эти вирусы как потенциально онкогенные. Есть и гены, ускоряющие апоптоз. У млекопитающих выявлены такие гены — Bax и Bad. Белки, кодируемые этими генами, функционируют в виде димеров. Возможно образование димеров из проапоптозного белка bах с антиапоптозным белком bcl–2 (bax—bcl–2). От баланса про- и антиапоптозных белков в клетке зависит, будет лимфоцит жить или погибнет.

Таким образом, физиологический апоптоз сопряжен с активацией и пролиферацией лимфоцитов. Это сопряжение настолько обязательно, что феномен гибели лимфоцитов после активации получил отдельное название — «индуцированная активацией смерть клеток».

Однако апоптоз может быть инициирован в клетке и факторами физического проникающего патогенного внешнего воздействия. Например, апоптоз запускается в клетках, в которых произошло радиационное повреждение ДНК в большем объёме, чем могут «исправить» ферменты репарации ДНК. Некроза клеток при этом нет, есть именно апоптоз. Внутриклеточным фактором, инициирующим программу на апоптоз в данном случае, вероятно, является некий белок с молекулярной массой 53 кДа, поэтому он обозначен p53. Физиологические функции этого белка неизвестны, неизвестно даже, функционирует ли он в норме. Но вот при дефектах в гене p53 развиваются опухоли. У нокаутированных мышей по гену p53 онтогенез примерно до 10–месячного возраста проходит без видимых отклонений, но после 10 мес практически все такие животные умирают от рака или саркомы. Так или иначе к настоящему времени сложилось представление, что белок p53 необходим для инициации апоптоза в клетках, в которых повреждена ДНК. Причины повреждений ДНК могут быть самые разные: вирусные инфекции, ионизирующая радиация, химический мутагенез и др. Если клетка не справляется с репарацией наступивших повреждений ДНК, то p53 запускает в этой клетке апоптоз. Эта рабочая гипотеза достаточно эффективно оправдывает себя в прикладных исследованиях по поиску фармакологических средств, предназначенных для защиты клеток от апоптоза. Такая проблема существует у онкологических больных во время курсов интенсивной противоопухолевой химиотерапии. Современные химиотерапевтические препараты — это цитостатики, большинство из них — антиметаболиты ДНК. Они токсичны не только для клеток опухоли, но и других делящихся клеток — эпителия слизистых оболочек и кожи, всех ростков кроветворения и др. Поэтому у больных в качестве побочных эффектов лечения развиваются анемия, лейкопения, тромбоцитопения, выпадают волосы, возникают проблемы с работой кишечника. Появилась и успешно разрабатывается идея временного фармакологического подавления в организме p53 только на период курса противоопухолевой химиотерапии. Временное отсутствие p53 спасет разные клетки от апоптоза, потенциально вызываемого химиопрепаратами, кроме клеток самой опухоли, поскольку в ней p53 и так не функционирует. Или, например, если тимоциты in vitro поместить в среду с температурой 43 °C, то они через некоторое время погибнут по механизму некроза. Но если те же тимоциты прогреть до той же температуры 43 °C в течение 3 мин, после чего «вернуть» к физиологической температуре 36,7 °C, то тимоциты будут все равно погибать, но по механизму апоптоза. Кроме того, постнатальный апоптоз возможен и не в лимфоидной ткани, например апоптоз гепатоцитов при алкогольных циррозах печени, при которых обнаружили экспрессию Fas и FasL именно на гепатоцитах.

· Глава 7
ИММУННЫЙ ОТВЕТ