Получение векторов с использованием фага лямбда

Создание векторных систем с использованием регуляторных элементов фага лямбда применяют для увеличения уровня экспрессии чужеродных генов в клетках Escherichia coll.

В принципе не составляет труда получить тысячи химерных плазмид, каждая из которых содержит специфический фрагмент, например ДНК человека, мыши или дрозофилы и посредством скрининга большого числа таких плазмид исследовать весь геном любого из этих организмов. Однако, как оказалось плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК не стабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размерах. Это связано с тем, что генетический материал ненужный для размножения плазмиды неизбежно утрачивается. Большие фрагменты хромосомной ДНК (размером около 15 кб) нестабильные в составе плазмид становятся весьма стабильными при встраивании их в специально сконструированные штаммы фага λ.

ДНК этого фага сравнительно невелика, гены его хорошо изучены и размножается он в бактериальных клетках очень интенсивно.При получении λ векторов используется то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага λ не нужна для репликации в E. coli, а функционирует только при интеграции фаговой ДНК в бактериальную хромосому (в состоянии лизогении). Были сконструированы специальные штаммы λ, в ДНК которых сайты для EcoR1 расположены таким образом, что правый и левый концевые фрагменты фаговой ДНК, необходимые для репликации остаются нетронутыми. После расщепления с помощью EcoR1 эти концевые фрагменты благодаря их сравнительно большим размерам легко отделить от всех остальных EcoR1-фрагментов и использовать затем для получения новых λ-подобных фагов, каждый из которых содержит левый и правый концевые фрагменты, а также вставку чужеродной ДНК размером около 15 кб. Удобным оказалось то обстоятельство, что для созревания фага λ его ДНК должна иметь длину около 45 кб, благодаря чему при конструировании химерных ДНК in vitro для последующего размножения отбираются только те из них, которые содержат оба конца фаговой ДНК и вставку чужеродной ДНК подходящего размера, т.е. около 15 кб. Этапы клонирования фрагмента ДНК мыши длиной 15 кб в бактериофаге λ, с использованием рестриктазы EcoR1 и соответствующих сайтов рестрикции в геномах фага и мыши представлены на рис. 21. Многие гены эукариот оказались длиннее 15 кб, а некоторые достигают 35-40 кб. Кроме того, клонирование в фаге λ обычно не

позволяет выделить два соседних гена в виде единой молекулы рекомбинантной ДНК. Поэтому клонирование значительно более длинных фрагментов ДНК в E. coli проводится в космидах. Космиды - это искусственные конструкции, созданные на основе плазмид и фага λ. Космида имеет последовательность ori, позволяющую ей реплицироваться в E. coli, селекционный маркёр ampr, полилинкер (сайт множественного клонирования) и так называемые cos-сайты встроенные из фага λ (рис. 22). Сos-сайты представляют из себя расположенные на обоих концах молекулы

ДНК фага λ комплементарные одноцепочечные участки величиной 12 нуклеотидов, благодаря которым линейная форма фага, соединяясь со своим соседом через cos-сайт образует длинную цепь из сотен фаговых ДНК или конкатамер. Ферменты, катализирующие упаковку фаговой ДНК, узнают в конкатемере два cos-сайта находящихся на расстоянии 35-45 кб выщепляют расположенную между ними ДНК и упаковывают её в головку фага. Поэтому, когда в относительно небольшую космиду, несущую cos-сайты, встраивается чужеродная ДНК размером 35-45 кб, молекула достигает необходимой длины что бы упаковаться в фаговую частицу. Затем полученные фаги, несущие вставленную чужеродную ДНК вводятся в клетки E. coli для последующего размножения (клонирования).

39. Природные векторы для растений. Организация Тi – плазмиды

Для растений используются следующие векторы, полученные на основе природных растительных векторов — Тi- и Рi-плазмиды.

Тi-плазмиды — это кольцевые молекулы ДНК длиной до 200 тыс. пар нуклеотидов, обнаруженные в клетках некоторых штаммов бактерии Агробактериум тумефациенс. Эти плазмиды проникают из бактерий в клетки растения, и часть ДНК Тi-плазмиды, так называемая Т—ДНК, встраивается в хромосомы растения и вызывает опухолевое заболевание, известное как корончатый галл. При этом осуществляется гиперпродукция фитогормонов: цитокининов и индолилуксусной кислоты (ауксина), а также синтез ряда производных аминокислот. Способностью трансформировать клетки двудольных растений обладают также определенные плазмиды Агробактериум ризогенис. У растений, зараженных этими бактериями, они вызывают усиленное образование корешков и поэтому называются Рi-плазмидами. Инфекционной частью Рi-плазмид также является Т—ДНК, которая содержится в хромосомных клетках корешков. Эти клетки быстро растут в культуре, и из них могут регенерироваться здоровые плодовитые растения. Поэтому Рi-плазмиды как потенциальные векторы более универсальны, чем Тi-плазмиды. Ti-плазмиды обеспечивают трансформацию нормальных клеток растений в раковые. Этим они приносят вред сельскому хозяйству, особенно виноградарству.

40. Банки генов и клонотеки

Банк генов (библиотека генов) – это набор фрагментов ДНК, в котором представлены все (или определенная часть) гены организма. Банк генов представляет собой культуру микроорганизмов (бактерии, дрожжи), в каждую клетку которых введена специальная ДНК (так называемый вектор), несущая один из фрагментов этого набора. Банк генов можно длительно хранить в замороженном состоянии и при необходимости выделять отдельные микроорганизмы, содержащие фрагменты ДНК с нужными генами, и размножать (клонировать) их. Клонированные таким способом гены выделяют из клеток и используют для решения различных теоретических и практических задач генетики, медицины (в том числе диагностики наследственных болезней) и биотехнологии.

Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или какую-либо известную его часть. При этом репрезентативная клонотека должна заключать в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов изучаемого генома.

41. Клонирование генов

Клонирование генов —это процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий in vitro.

Прежде чем получить множество копий гена, его нужно сначала отделить от остального генома. Первый этап — создание библиотеки, в которой ДНК генома разбита на куски. Для создания библиотеки необходим вектор. Самыми распространенными векторами являются плазмиды. ДНК генома из донорского организма разрезается на множество фрагментов ферментами рестрикции, которые также разрезают ДНК-плазмиды в одном месте. Фрагменты геномной ДНК и разрезанной ДНК-плазмиды смешивают. Их липкие концы соединяются друг с другом. В результате образуется множество различных плазмид, каждая из которых несет фрагмент донорской ДНК. Эти плазмиды вводятся в клетки бактерий-реципиентов. Трансформированные бактериальные клетки распределяют тонким слоем по агару, так что каждая клетка может размножаться отдельно от остальных. Плазмида, используемая в качестве вектора, обычно несет гены устойчивости к двум антибиотикам. Бактерии, получившие плазмиды без клонированного в них чужого фрагмента ДНК, выживают на агаре с каждым из двух антибиотиков. А вот клетки, несущие плазмиды, в которые встроена чужеродная ДНК, будут расти на агаре только с антибиотиком, ген устойчивости к которому не был разрушен ферментом рестрикции. Эти клетки, у которых чужой ген встроен в ген устойчивости ко второму антибиотику, сформируют колонии, или клоны. Все клетки в каждой колонии будут нести множество копий исходной ДНК, но каждая из них будет также содержать копию нового, чужеродного фрагмента ДНК.

42. Экспрессия чужеродной генетической информации в клетках бактерий, дрожжей, растений и животных

При изучении экспрессии чужеродных генов в растительных клетках исследователи столкнулись с рядом новых явлений. Выяснилось, что трансформированные идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена. Показано, что уровень экспрессии зависит от многих факторов и в значительной мере от того в какую область ядерного хроматина попал введенный ген.

Экспрессия трансгена, как правило высока при его попадании в область активного хроматина. Кроме того, оказалось, что при встраивании в ядерный геном конструкция ДНК нередко претерпевает существенные изменения (перестройки, дупликации, инверсии и т.д.), что также приводит в основном к снижению экспрессии.

Было установлено также, что обычно применяемые процедуры трансформации вовсе не безразличны и для хозяйского генома.

Во-первых, встраивание трансгена может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации.

Во-вторых, при агробактериальном или физическом переносе генов в растительный геном в последнем нередко отмечаются разного рода перестройки, вплоть до транслокации фрагментов хромосом. Все это также может менять нормальное функционирование генома растения.

Еще одна важная проблема, которая открылась благодаря генетической инженерии растений - это проблема замолкания генов (gene silencing). Было обнаружено, что у достаточно заметной доли трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то время теряет свою активность, хотя физически сохраняется в геноме. Таким образом, было установлено, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК.

Проблема замолкания генов имеет большое практическое значение, так как у генетически трансформированных сельскохозяйственных культур трансгены должны функционировать стабильно. За последние годы удалось выяснить механизмы и некоторые условия, способствующие замолканию генов. Одним из основных факторов является число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов. Откуда следуют практические рекомендации генным инженерам: трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный геном; сигнальные части трансгена (промоторы, терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологий (более 100-300 п.о. ДНК) с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед трансформацией.

Уровень и стабильность экспрессии трансгенов в растении можно повысить при специальном конструировании концов вводимой ДНК. Так, добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение через трансген РНК-полимеразы, если промотор хозяйского генома случайно оказывается поблизости от места встраивания. При концевом добавлении сравнительно коротких (>300 п. о.) участков связывания ядерного матрикса (MAP) трансген имеет больше шансов образовать независимую петлю хроматина или включиться в состав транскрибируемого эухроматина. В обоих случаях это приводит к повышению и стабилизации уровня экспрессии трансгена.

В ряде случаев, особенно у злаков, введение интрона в район 5'-конца мРНК целевого гена резко усиливает его транскрипцию. Помимо этого, в составе мРНК обнаружены цис-элементы, определяющие степень ее стабильности в растительной клетке. Правильный генно-инженерный дизайн таких элементов может также способствовать оптимальному накоплению мРНК в трансгенных растениях, предназначенных для биотехнологического применения.

Стабильно введенный ген должен передаваться потомству при семенном размножении, поэтому важно определить этот параметр на практике. Уровень транскрипции введенного гена оценивается обычно с помощью традиционного Northern-блотинга или недавно предложенных количественных версий RT PCR (на мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется комплементарная цепь ДНК, которая и размножается в полимеразной цепной реакции). В ряде случаев экспрессию гена проще и надежнее контролировать по конечному белковому продукту или тому эффекту, который этот белок вызывает.

Однако необходимо использование разных методов для доказательства истинной трансгенности данного растения, чтобы исключить "псевдотрансгенные" черты, вызванные сомаклональной (эпигенетической) изменчивостью или неполной элиминацией агробактерий

Для изучения молекулярной конституции генома трансгенных организмов можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. Метод основан на том, что гомологичные последовательности ДНК гибридов и их родителей при разрезании рестриктазами могут попасть во фрагменты разной длины. В качестве маркеров родительских геномов можно использовать и часто повторяющиеся последовательности ДНК. Повторяющиеся последовательности составляют значительную часть генома типичного растения. Большая часть последовательностей повторяется до 1000 раз на геном. У многих растений выявлены еще более частые повторы (100000 - 1000000 копий на геном), которые составляют до 20% генома. Они имеют отличный от остальной клеточной ДНК "Г - Ц" состав и в градиенте хлористого цезия выявляются в виде сателлитного компонента. В геномах даже очень близких видов амплифицируются разные типы повторов, поэтому они становятся своеобразными "отпечатками пальцев" близкородственных геномов. Высокотандемные последовательности ДНК относительно легко клонируются, так как после расщепления рестриктазой, имеющей сайт узнавания в повторе, эти последовательности легко выявляются в виде полос при электрофоретическом разделении фрагментов и могут быть элюированы из геля в чистом виде. Их можно использовать в качестве зондов. Использование высокоповторяющихся последовательностей в качестве молекулярных зондов позволяет вести одновременный скрининг большого количества образцов грубоочищенной ДНК регенерировавших после слияния протопластов растений или каллусов методом дот-гибридизации.

Как другой биохимический маркер при анализе соматических гибридов может использоваться рибулозо - 1, 5 - бифосфат карбоксилаза/оксигеназа. Причины: необычайно высокое содержание его в листьях (до 50% растворимого белка), хорошо разработанные методы выделения и анализа, а также то, что составляющие этот белок субъединицы кодируются как ядерным (мол. масса 14 кД), так и хлоропластным (большая субъединица, мол. масса 55 кД) геномами.