МУК 4. 2. 2218-07

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2218-07

(с изм., внесенными МУК 4.2.2218-07,

утв. Роспотребнадзором 18.01.2008)

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина); Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" (Ю.М. Ломов, Б.Н. Мишанькин, Л.С. Подосинникова, Л.Г. Воронежская, И.Я. Черепахина, Т.А. Кудрякова, Б.Л. Мазрухо, Л.М. Смоликова, И.В. Рыжко, Р.И. Цураева, Э.А. Москвитина, Б.П. Голубев, С.О. Водопьянов, Е.В. Монахова, В.Д. Кругликов, Н.Р. Телесманич, А.Б. Мазрухо, В.В. Агафонова); Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Противочумный Центр" (А.А. Кюрегян, С.М. Иванова, Ю.С. Королев); Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (А.К. Адамов, З.В. Малыхина, Т.В. Бугоркова, Н.И. Смирнова, Л.Ф. Ливанова; А.В. Топорков, С.И. Заднова, Н.А. Осина, Е.С. Казакова, Н.Б. Челдышева, А.В. Осин); Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт" (А.С. Марамович, В.С. Ганин, Л.Я. Урбанович, В.И. Погорелов, Л.В. Миронова, Е.С. Куликалова); Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" (В.Н. Савельев); Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Причерноморская противочумная станция" (Г.В. Гальцева); Государственным Центром по антибиотикам (С.В. Сидоренко); Российской медицинской академией последипломного образования (Е.А. Ведьмина); ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Т.И. Анисимова, Л.В. Саяпина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 мая 2007 г.

3. Введены взамен Методических указаний "Лабораторная диагностика холеры" МУ 4.2.1097-02.

1. Область применения

1.1. Методические указания "Лабораторная диагностика холеры" разработаны для внедрения и применения действующих нормативных документов, определяющих требования к эпидемиологическому надзору за холерой в части, касающейся организации и проведения лабораторной диагностики холеры.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.

2. Нормативные ссылки

КонсультантПлюс: примечание.

В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционной заболеваемости человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" имеет номер СП 1.2.1318-03, а не СП 1.3.1318-03.

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционной заболеваемости человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами. СП 1.3.1318-03".

2.2. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности. СП 1.3.1285-03".

2.3. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. СП 1.2.036-95".

2.4. Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами. СП 1.2.731-99".

2.5. Санитарные правила "Условия транспортировки и хранения медицинских иммунобиологических препаратов. СП 3.3.2.028-95".

2.6. Методические указания "Организация работ при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03".

2.7. Санитарные правила "Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору. СП 3.1.1086-02".

3. Характеристика возбудителя холеры

Холера - острая инфекционная болезнь с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом заражения, пищевым, водным и контактно-бытовым путями распространения возбудителя. Относится к группе инфекций, борьба с которыми регламентируется Международными медико-санитарными правилами (2005).

Возбудителями холеры являются холерные вибрионы О1 (классического и эльтор биоваров) и О139 серогрупп.

+

Токсигенные (ctx) холерные вибрионы обеих серогрупп вызывают

заболевание холерой, склонное к эпидемическому и пандемическому

распространению (эпидемически значимые штаммы), нетоксигенные

-

(ctx) - единичные или групповые заболевания холерой при общем

источнике заражения.

-

У нетоксигенных (ctx) штаммов холерных вибрионов возможно

присутствие отдельных генов патогенности, среди которых

определенную значимость имеет ген tcp, участвующий в реализации

процесса адгезии.

Характеристика генома выделенных холерных вибрионов биологическими методами широко используется для эпидемиологического анализа и оценки эпидемической значимости выделенных штаммов.

4. Организация лабораторных исследований

Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить:

- бактериологические лаборатории учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, лечебно-профилактических и противочумных учреждений, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;

- лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора и ведомств, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру;

- лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры.

Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:

- безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности - для бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактических учреждений;

- безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности - для лабораторий (отделов) особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, ведомств и противочумных учреждений;

- порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов IV группы патогенности.

Порядок получения лабораториями разрешения на диагностические исследования на холеру определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.

В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическим лабораториям учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и другим, функционирующим в составе лабораторной службы очага, в случае расширения их функциональных обязанностей представляется решением медицинского штаба очага.

4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора

4.1.1. Бактериологические лаборатории учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактические учреждения проводят плановые диагностические исследования на холеру материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном действующими нормативными документами по эпидемиологическому надзору за холерой.

Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на стекле (далее - слайд-агглютинации) с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, РО и О139.

При положительном результате слайд-агглютинации немедленно сообщают в органы Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации, культуру для окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.

При отрицательном результате слайд-агглютинации:

- не агглютинирующиеся холерными сыворотками О1 и О139 культуры, выделенные от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию;

- не агглютинирующиеся холерными сыворотками О1 и О139 культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в учреждение Роспотребнадзора.

4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора и ведомств:

- выполняют диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;

- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп по регламентированным для этих лабораторий тестам;

- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;

- представляют оперативную информацию о выделении культур холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп;

- в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется;

- в течение 5 дней после окончания идентификации передают в территориальное противочумное учреждение или в головной по проблеме "Холера" Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт все культуры холерных вибрионов О1, О139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при выделении от больных;

- контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.

4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:

- проводят исследования материала от больных и умерших с подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов окружающей среды;

- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;

- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность культур;

- осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;

- в установленном порядке выделенные культуры холерных вибрионов с паспортами передают в территориальный противочумный институт, головной по проблеме "Холера" Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, одновременно паспорта на эти же культуры направляют в противочумный центр Роспотребнадзора.

Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за холерой осуществляют в соответствии с действующими нормативными и методическими документами. Профилактические исследования на холеру проводят в течение рабочего дня с использованием соответствующих питательных сред, диагностические исследования материала от подозрительных на холеру больных (трупов) - в условиях круглосуточного режима работы лаборатории.

4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий

Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляются в соответствии с действующими нормативными документами по организации и проведению противохолерных мероприятий.

5. Бактериологическое исследование

В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает бактериологический анализ, от правильности и своевременности проведения которого зависит характер и объем профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Исследования проводят с целью:

- выявления больных холерой и вибриононосителей;

- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;

- обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;

- бактериологического контроля эффективности лечения больных холерой и вибриононосителей;

- бактериологического контроля объектов окружающей среды, в том числе поверхностных водоемов;

- бактериологического контроля эффективности обеззараживания в очаге инфекции.

5.1. Отбор и доставка материала на исследование

Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.

Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель является ответственным за правильность отбора, хранения и своевременность доставки проб в лабораторию.

Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных

вибрионов к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность

антагонистического действия сопутствующей микрофлоры и

предполагаемую концентрацию возбудителя в исследуемом материале.

Если в материале от больных алгидной формой холеры концентрация

6 9

возбудителя достигает 10 - 10 м.к./мл, то в испражнениях больных

легкой формой и леченных антибиотиками, реконвалесцентов и

носителей количество холерных вибрионов обычно не превышает

2 4

10 - 10 м.к./г.

Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим жаром или кипячением в 2%-м растворе пищевой соды.

Материал для исследования должен быть доставлен не позже чем через 2 ч после его взятия. В случае удлинения сроков доставки используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно эффективной является 1%-я пептонная вода (рН 8,4 +/- 0,1).

В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры может быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000 - 1:200000 или моющее средство "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%. В отдельных случаях для транспортирования материала могут быть использованы солевые консерванты (см. раздел 7).

На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с указанием названия среды и даты ее приготовления.

Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, рекомендуется хранить не более 2-х суток при температуре не выше (10,0 +/- 0,2) °С при условии сохранения их стерильности. Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора проб средами в закатанных флаконах.

При наличии у больного диареи материал забирают до начала этиотропной терапии в количестве 10 - 20 мл, у больных легкими формами - 1 - 2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал направляют в лабораторию нативным и в 1%-й пептонной воде. В транспортную среду вносят 1 - 2 мл или 1 - 2 г материала на 5 - 6 мл среды.

При вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию (длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать полоски фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими испражнениями пропитывают полоску обычной плотной промокательной бумаги или другого гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет для предохранения от высыхания при транспортировании в лабораторию. На таких полосках холерные вибрионы выживают до четырех - пяти или более недель, пока сохраняется влага.

При обследовании на вибриононосительство материал забирает медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений, в очаге создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством эпидемиологов.

Материал в количестве 1 - 2 г может быть доставлен на исследование нативным, в 1%-й пептонной воде или другой транспортной среде.

5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой, вибриононосителей и контактных с ними лиц секционного материала

Испражнения и рвотные массы в количестве 10 - 20 мл собирают в стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для обеззараживания кипячением.

Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.

Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты вводят в прямую кишку на глубину 5 - 6 см, собирают им содержимое со стенок кишечника и опускают во флакон или пробирку с 1%-й пептонной водой.

Стандартную стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед забором материала смачивают стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида и вводят в прямую кишку на 5 - 6 см. Взятый материал переносят во флакон или пробирку с 1%-й пептонной водой.

Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.

От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез производят между двойными лигатурами, предварительно наложенными на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10 мл и перенести в емкость с 1%-й пептонной водой. Взятые образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.

Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в Прилож. 1.

5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды

Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.

Из водопроводных кранов пробы воды берут после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин. при полном открытии крана.

Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10 х 10 см, сложенных в 10 - 15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через сутки помещают в стерильную банку и доставляют в лабораторию.

Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах доставляют в лабораторию.

Ил и фитопланктон (водоросли) также помещают в стерильные банки и транспортируют в лабораторию.

Исследовать зоопланктон (дафнии, циклопы и др.) можно групповым методом, объединяя в один посев 10 - 30 образцов, отловленных на одном участке водоема. В этом случае они могут быть доставлены в одном сосуде. При исследовании рыб берут содержимое желудка и жабры.

Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или марлевым тампоном, смоченным 0,9%-м раствором натрия хлорида, с поверхности площадью 10 х 10 см. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1%-й пептонной водой.

Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают 1%-ю пептонную воду с 1% сахара.

Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют основной пептон до 1%-й концентрации.

Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют направление (Прилож. 2) и отправляют в лабораторию с нарочным согласно действующим СП.

Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в Прилож. 3, 4.

5.2. Порядок исследования

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации.

Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты, приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7. Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке.

Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С.

Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1%-й пептонной воде 6 - 8 ч, в пептонной воде с теллуритом калия - 12 - 18 ч, на щелочном агаре - не менее 14 - 16 ч, а на плотных элективных средах - 18 - 24 ч. Теллурит калия следует добавлять в 1%-ю пептонную воду с рН не ниже 8,3 +/- 0,1 до внесения исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с теллуритом калия - не более 2-х суток при условии содержания их в холодильнике.

5.2.1. Исследование проб от больных и вибриононосителей секционного материала (рис. 1)

┌────────────────────────────────────────────────┐

│ Исследуемый материал │

└───┬───────┬─────────────────────────────────┬──┘

│ \/ \/

\/ ┌────┐──────────────────────────>┌──────────────────┐

┌──────┐ │ I │ ┌────┐ │Ускоренные методы:│

│ЩА, ЭС│ └─┬──┘──────────>│ II │─────────>│- МФА │

└───┬──┘ │ └─┬──┘ │- РИВ │

│ \/ \/ │- РНГА │

│ ┌──────┐ ┌────┐ │- ПЦР │

│ │ЩА, ЭС│ │ ЩА │ │ │

│ └──┬───┘ └─┬──┘ │ │

\/ \/ \/ │ │

┌──────────────────────────────────────────┐ │ │

│- отбор колоний │ │ │

│- высев подозрительных колоний на ЩА и ПУС│ │ │

└────────────────────────────────┬─────────┘ └──────────────────┘

\/

┌─────────────────────────┐

│Отбор культур по ПУС и ОП│

└────────────┬────────────┘

\/

┌──────────────┬────────────┬──────────┬─────────┬──────────┐

\/ \/ \/ \/ \/ \/

┌────┐ ┌─────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐

│ПУС+│ │ПУС+*│ │ОП+*│ │ПУС-│ │ПУС-│ │ПУС+│

│ОП+ │ │ │ │ │ │ОП+ │ │ОП- │ │ОП- │

└─┬──┘ └─────┘ └────┘ └─┬──┘ └─┬──┘ └─┬──┘

└──────────────────┬───────────────────┘ │ \/

\/ \/ ┌─────────┐

+ ┌─────────────────────────────────┐ - ┌─────────┐│Исследуют│

┌─┤ ОРА с сыворотками О1 и О139 ├───┐ │ Не ││ на │

│ └─────────────────────────────────┘ │ │исследуют││кишечную │

│ │ └─────────┘│ группу │

\/ \/ └─────────┘

┌─────────────────────────────────────┐┌─────────────────────────┐

│Сокращенная схема идентификации: ││Определение │

│- морфология и подвижность микробных ││принадлежности к роду │

│клеток ││Vibri, виду V. Cholerae │

│- ОП ││или другим видам │

│- O/F тест и отношение к отдельным ││патогенных вибрионов │

│углеводам и аминокислотам (табл. 4) │└─────────────────────────┘

│- МФА │

│- РИВ │

│- РА с сыворотками О1, Инаба, Огава, │

│РО или О139 │

│- чувствительность к фагам холерным │

│классическому и эльтор │

│Ориентировочная оценка эпидемической │

│значимости: │

│- гемолитическая активность по Грейгу│┌─────────────────────────┐

│- чувствительность к фагам холерным ││Условные обозначения: │

│ + - ││I и II - среда │

│эльтор ctx и ctx ││накопления; ЩА - щелочной│

├─────────────────────────────────────┤│агар; ЭС - элективная │

│Дополнительные признаки биовара ││среда для выделения │

│V. cholerae: ││холерных вибрионов; ПУС -│

│- гемагглютинация; ││полиуглеводная среда; │

│- чувствительность к полимиксину В ││ОП - оксидазная проба; │

│50 ЕД/мл ││ОРА - ориентировочная │

│- реакция Фогес-Проскауэра ││реакция агглютинации; │

├─────────────────────────────────────┤│РА - развернутая реакция │

│Определение антибиотикограммы ││агглютинации; МФА - метод│

│Окончательная оценка эпидемической ││флюоресцирующих антител; │

│значимости: ││РИВ - реакция │

│- ПЦР на наличие ctx АБ (А) и tcp А ││иммобилизации вибрионов; │

│генов ││РНГА - реакция непрямой │

│- токсигенность на кроликах-сосунках ││гемагглютинации; │

├─────────────────────────────────────┤│ПЦР - полимеразная цепная│

│Уточнение родовой и видовой ││реакция; │

│принадлежности атипичных культур по ││* - в случае отбора │

│расширенному набору признаков ││колоний только на ПУС или│

│(табл. 2, 3) ││ЩА │

└─────────────────────────────────────┘└─────────────────────────┘

Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру

I этап

Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника, желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого кишечника трупа в объеме 0,5 - 1,0 мл засевают пипеткой в 50 - 100 мл накопительной среды, петлей - на щелочной агар и одну из элективных сред (СЭДХ, TCBS).

При исследовании материала от больных с подозрением на заболевание холерой не допускается использование в качестве накопительной среды 1%-й пептонной воды с теллуритом калия.

В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру могут быть использованы ускоренные методы исследования: иммуно-люминесцентный, иммобилизация и ПЦР со специфическими праймерами (см. раздел 6) на первом, втором и последующих этапах исследования.

Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл - при групповых, объединяя в один флакон по 0,5 - 1,0 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при проведении массовых обследований на вибриононосительство.

Материал, доставленный в 5 мл 1%-й пептонной воды, полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1%-й пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2-х ч после забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1%-й пептонной воды.

В отдельных случаях при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к возбудителю холеры, его засевают в 200 - 300 мл 1%-й пептонной воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч, производя последовательные высевы через 8 - 10 ч инкубации с поверхностного слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте исследования нецелесообразно.

II этап (через 6 - 8 ч от начала исследования)

С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну из элективных сред и в 5 - 8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.

При отрицательных результатах исследования нативного материала ускоренными методами их повторяют после 6 ч инкубации первой среды накопления.

III этап (через 12 - 16 ч от начала исследования)

Высев со второй среды накопления на щелочной агар.

В случае необходимости ускорения хода анализа материала от больного, подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний со щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.

IV этап (через 18 - 24 ч от начала исследования)

Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й накопительных сред.

а) Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и идентификации культуры.

На щелочном агаре колонии холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете (Прилож. 5).

Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные. Размеры колоний на щелочном агаре через 10 - 12 ч инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18 - 24 ч достигают 2 - 3 мм в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько замедлены, поэтому просмотр посевов на СЭДХ или TCBS следует проводить не ранее чем через 18 - 20 ч инкубации, когда размеры их становятся близки к колониям, вырастающим на щелочном агаре.

В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые. Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных вибрионов, а также на морфологию клеток.

б) При отборе колоний можно использовать пробу на индофенолоксидазу с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола) с индикаторными бумажками из набора СИБ-1 для идентификации вибрионов или - тест-системы ОКСИ-тест. С колониями, обнаруженными на элективных средах, пробу на оксидазу ставить не рекомендуется.

в) Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с сывороткой холерной О1 в разведении 1:50 - 1:100. При положительной реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят слайд-агглютинацию с вариантоспецифическими сыворотками Инаба и Огава в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных, проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О139 и РО.

Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной О1 сывороткой в разведении 1:100 и вариантоспецифической в разведении 1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими иммуноглобулинами в сочетании с морфологическими, культуральными признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона О1, а в случае положительной реакции с сывороткой О139 - холерного вибриона О139 серогруппы.

г) Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не агглютинирующиеся холерными О1 и О139 сыворотками, отсевают на одну из полиуглеводных сред (лактозо-сахарозная, Ресселя, Клиглера, маннозо-сахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и определения чувствительности к антибиотикам.

V этап (через 24 - 36 ч от начала исследования)

Отбор культур для идентификации.

На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для вибрионов характером роста и изменениями:

- на двууглеводных средах (лактозо-сахарозная, глюкозо-лактозная и Клиглер) наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа, а также сероводорода, продуцируемого в среде Клиглера, отдельными штаммами за счет расщепления серосодержащих компонентов;

- в маннозо-сахарозной среде за счет ферментации обоих углеводов окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также в отдельных случаях улавливается образование сероводорода.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие индофенолоксидазы.

Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с помощью окрашенных по Граму мазков.

Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных средах и положительные в пробе на оксидазу, проверяют в ориентировочной слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1 в разведении 1:100, РО, Инаба и Огава - в разведении 1:50. При отрицательных результатах с этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой О139 серогруппы, используя ее в соответствии с инструкцией по применению.

На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками О1, Инаба или/и Огава выдают предварительный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона О1 соответствующего серовара.

Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой О139 при отрицательных результатах с сыворотками О1 серогруппы, выдают ответ о выделении холерного вибриона О139 серогруппы.

Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или на щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся сыворотками О1, РО или О139 серогрупп оксидазопозитивных культур по сокращенной или полной схеме, не агглютинирующихся холерными О1, РО и О139 сыворотками - до определения вида с учетом основных родовых признаков.

VI этап (через 36 - 48 ч от начала исследования)

Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара.

Для холерных вибрионов О1 эпидемическую значимость

ориентировочно оценивают по тестам гемолитической активности и

+ -

чувствительности к фагам эльтор ctx и ctx, а в

специализированных учреждениях - окончательно по результатам ПЦР

или генетического зондирования на присутствие в геноме выделенной

культуры ctx AB (А) гена, а также токсигенности на модели

кроликов-сосунков. Эпидемическую значимость холерных вибрионов

О139 серогруппы определяют по тем же тестам, кроме

+ -

чувствительности к фагам эльтор ctx и ctx. К окончанию этого

этапа исследования должна быть определена

антибиотикочувствительность выделенной культуры.

При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками О1 и О139, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не О1 и не О139. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (О2 - О83).

Идентификацию культур, агглютинирующихся РО-сывороткой, см. в разделе 5.3.

5.2.2. Исследование объектов окружающей среды

Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы исследования материала от больных только на I этапе, II - VI этапы изложены выше.

а) Вода поверхностных водоемов и водопроводная

В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:

- к исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до 1%-й концентрации, определяют рН, в случае необходимости подщелачивают 10%-м раствором едкого натрия до рН 8,4 +/- 0,1. Время инкубации в 1-й среде накопления - 8 - 10 ч. Объем 2-й среды накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия - 6 ч, а с теллуритом калия - 18 - 20 ч;

- в исследуемую воду добавляют раствор основного пептона до 1%-й концентрации и теллурит калия из рабочего разведения 1:1000 до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными проверки. Устанавливают рН 8,4 +/- 0,1. Время инкубации 18 - 24 ч; вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия, время инкубации 6 - 8 ч;

- исследование проб воды можно также проводить с использованием в качестве ингибитора посторонней флоры моющего средства "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%; после добавления основного раствора пептона до 1%-й концентрации и установления щелочной реакции пробы сохраняют при комнатной температуре (не выше 25 °С) до утра (первая среда накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя в 100 мл 1%-й пептонной воды (вторая среда накопления) и делают высев на щелочной агар; высев со второй среды накопления производят через 6 - 8 ч инкубации;

- воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или 3, смыв с которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими холерными иммуноглобулинами, а также ставить РНГА, ПЦР со специфическими праймерами.

При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать III среду накопления.

б) Хозяйственно-бытовые сточные воды

Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).

После добавления к пробам основного раствора пептона до 1%-й концентрации устанавливают рН 8,4 +/- 0,1 и инкубируют в объемах по 500 мл 8 - 10 ч (1 среда накопления) или с добавлением теллурита калия 1:100000 (1:200000) - 18 - 24 ч.

При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние помещают в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и далее исследуют, как указано выше.

в) Гидробионты

Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают уколом иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске брюшком вверх. Поверхность брюшка обрабатывают спиртом и ножницами делают медиальный разрез. Желчный пузырь отсекают от печени, разрезают и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50 - 100 мл 1%-й пептонной воды. Содержимое желудка засевают в 1%-ю пептонную воду, а внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на агаровые пластинки. Посев кишечника делают таким же образом, отсекая несколько петель в верхнем, среднем и нижнем отделах кишечника.

У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника и жабры. Мелких рыб (мальков) измельчают ножницами по 10 - 20 экз. в одной пробе и делают посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1%-ю пептонную воду.

Дафний, циклопов и других рачков, так же, как и фитопланктон, растирают в ступке и засевают петлей в 1%-ю пептонную воду.

У раков исследуют кишечник и жабры, делая посев содержимого в среду накопления и слизистой стенки - отпечатком на агаровую среду.

г) Пищевые продукты

Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.

Молоко в количестве 5 мл сеют в 50 - 100 мл среды накопления или к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1%-й концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир, сметану, творог, мороженое и т.д.) в количестве 5 - 10 мл засевают в 1%-ю пептонную воду.

Из твердых пищевых продуктов берут навеску 25 г, растирают в стерильной ступке с 2 - 3 г кварцевого песка и физиологическим раствором, а затем переносят в 125 мл накопительной среды и петлей на агаровые среды.

Масло засевают в жидкую среду накопления в количестве 5 - 10 г, размягчив его в термостате, или делают посев смыва с поверхности его кусков.

После посева продукта устанавливают рН среды 8,4 +/- 0,1.

д) Смывы с объектов внешней среды и мух засевают в 1%-ю пептонную воду и исследуют по обычной схеме.

5.2.3. Порядок исследования в условиях односменной работы лаборатории

При осуществлении эпиднадзора за холерой исследование материала от обследуемых контингентов может выполняться в следующих вариантах.

а) В качестве 1-й или 2-й среды накопления используют 1%-ю пептонную воду (рН 8,4 +/- 0,1) с теллуритом калия в конечной концентрации 1:100000 - 1:200000 в соответствии с результатами его контроля.

Вопрос выбора транспортной среды и порядок исследования решают в зависимости от разницы времени с момента взятия пробы до поступления ее в лабораторию. Примерная схема забора материала от больных в 1%-ю пептонную воду и порядок дальнейшего его исследования на холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлены в табл. 1. В течение рабочей недели для отбора проб используют 1%-ю пептонную воду без теллурита калия в объеме 5 - 10 мл, во флаконах или пробирках (транспортная среда).

Пробы до отправки в лабораторию сохраняют при комнатной температуре (24,0 +/- 1,0) °С в биксах, ящике, шкафу и т.д. в специально выделенной комнате, закрывающейся на замок. Продолжительность сохранения проб в указанных условиях - до 24 ч.

В случаях, когда температура в помещении превышает 25 °С, материал следует брать в 1%-ю пептонную воду с теллуритом калия.

В лаборатории в пробы во флаконах доливают соответствующую среду накопления до 50 мл, а из пробирок все 5 - 10 мл транспортной среды с материалом переносят пипеткой в 50 мл среды накопления.

На период выходного дня лаборатории в порядке исключения допускается следующий вариант: забор материала в 50 мл 1%-й пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда); допускаемое время сохранения проб до начала исследования при температуре (20,0 +/- 1,0) °С - 60 ч, (27,0 +/- 3,0) °С - 48 ч. В лаборатории 5 - 10 мл поверхностного слоя среды с материалом переносят в 50 мл 1%-й пептонной воды без теллурита калия (1 среда накопления) и делают высев на чашку щелочного агара с дальнейшим исследованием по изложенной схеме.

б) Пептонную воду повышенной щелочности в качестве накопительной среды рекомендуется использовать только на первом этапе исследования с удлинением срока инкубации ее до 18 - 24 ч. Основной раствор пептона и 1%-ю пептонную воду с рН 9,5 +/- 0,5 можно готовить впрок по общепринятой методике с подщелачиванием до необходимого уровня и последующей стерилизацией при температуре 120 °С - 20 мин.

Для подщелачивания пептонной воды используют 10 - 20% NaOH.

Таблица 1

ПОРЯДОК ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛА В ЗАВИСИМОСТИ

ОТ ВРЕМЕНИ ОТБОРА И ДОСТАВКИ ЕГО В ЛАБОРАТОРИЮ В 1% ПВ

5.3. Идентификация культур холерных вибрионов

Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (О1, О139 или других).

К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но неактивные в отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.

┌──────────────────────┐

│Семейство Vibrionaceae│

│Shewan and Veron, 1965│

└──────────┬┬──────────┘

│└───────────────────┐

\/ \/

┌──────────────────────┐ ┌────────────────────┐

│ Типовой род Vibrio │ │Другие роды: │

│ Pacini, 1854 │ │- Aeromonas │

└─────────┬──┬─────────┘ │Kluyver et Van Niel,│

┌──────────────────────┐ │ │ │1936 │

│другие виды вибрионов,│<────┘ │ │- Enhydrobacter │

│в т.ч. патогенных для │ \/ │Staley et al, 1987; │

│человека │ ┌───────────────┐ │- Photobacterium │

│- V. alginolyticus │ │ Типовой вид │ │Beijerinc, 1889; │

│- V. cincinnatiensis │ │Vibrio cholerae│ │- Plesiomonas Habs │

│- V. damsela │ └──────┬────────┘ │et Schubert, 1962 │

│- V. fluvialis │ │ └────────────────────┘

│- V. furnissii │ │

│- V. harveyi │ \/

│- V. hollisae │ ┌───────────────┐

│- V. metschnikovii │ │ Серогруппы │

│- V. mimicus │ └─┬────┬──────┬─┘

│- V. parahaemolyticus │ │ │ │

│- V. vulnificus │ │ │ │

└──────────────────────┘ │ │ │

│ \/ │

┌───────┐ │ ┌───────┐ │ ┌───────┐

│ О1 │<─────────────┘ │ О139 │ └───>│ non │

│ ├────────┬───────┤ │ │О1/О139│

└───┬───┘ │ └───────┘ └───┬───┘

│ \/ │

│ Возбудители холеры Возбудители │ гастроэнтеритов

│ и системных │ инфекций

\/ \/

┌────────────────┐ ┌──────────────────────┐

│ Биовары │ │V. cholerae О2 - О138,│

└──────┬─┬───────┘ │О140 - О206... │

┌──────┘ └───────┐ │(по международной │

│ │ │классификации) │

\/ \/ │V. cholerae О2 - О83 │

V. cholerae V. cholerae │(по отечественной │

cholerae eltor │классификации) <2> │

│ │ └──────────────────────┘

└────┐ ┌────┘

\/ \/

┌────────────────┐

│ Серовары: │

│ Inaba │

│ Ogava │

│ Hikojima │

└────────────────┘

Рис. 2. Классификация вибрионов <1>

--------------------------------

<1> Таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1994;

<2> Типовые штаммы О2 - О39 соответствуют Sakazaki (1970); О40 - О83, а также О12; О23 и О26 не изучены в сравнении с международной коллекцией типовых штаммов.

Таблица 2

ОСНОВНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ РОДА VIBRIO

И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ