Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по AluI-маркеру гена соматотропина

После обработки продукта ПЦР длиной 223 н.п. эндонуклеазой AluI в анализируемых группах крупного рогатого скота были с разной частотой выявлены L и V- аллели гормона роста поAluI-маркеру. На рисунке 3.4.2.1, приведена электрофореграмма с рестрикционным анализом при определении генотипов соматотропина по AluI-маркеру. Частоты встречаемости аллелей и генотипов соматотропина по AluI -маркеру представлены в таблице 3.4.2.1.

Из таблицы 3.4.2.1. видно, что в группах коров и телят черно-пестрой породы, содержащихся ОАО "Снежка-Госома" отсутствует VV-генотип. Несмотря на это, не отмечено достоверного отклонения выявленных частот аллелей от теоретически рассчитанных по Харди-Вайнбергу. Вероятно, V-аллель в этих группах в достаточном количестве представлен в гетерозиготном состоянии, это отражается в превышении значений Hobs над Hex.

В группах коров айрширской породы и частного скота встречаются единичные животные с VV генотипом, основная масса V аллеля также находится в гетерозиготном состоянии. В этих группах отмечаются приближенные значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности.

Рис 5. Электрофоретический анализ продуктов рестрикции при определении генотипа соматотропина по AluI-маркеру. 1 – маркер молекулярных масс М27 (СибЭнзим); Генотипы образцов 2-9 указаны на фотографии. Генотипу LL соответствует продукт 171 и 52 п.н., генотипу LV – 223, 171 и 52 п.н. и генотипу VV – 223 п.н.

Таблица 3.4.2.1

Генетическая структура анализируемых групп коров по AluI-маркеру гена соматотропина.

На рисунке 3.4.2.2 приведена гистограмма с соотношением частот генотипов соматотропина по MspI- и AluI – маркерам в анализируемых группах КРС. Из гистограммы видно, что во всех анализируемых группах преобладают животные с гомозиготным генотипом LL и (+/+). Наивысшая частота LL генотипа выявлена в стаде коров черно-пестрой породы, (+/+) -генотип чаше встречается в группе частного скота. Генотип VV во всех группах встречались намного реже. В стаде коров Айрширской породы, по сравнению с другими группами, была установлена наивысшая частота гетерозигот по двум маркерам, но практически не отсутствовал (-/-)-генотип.

Рис.3.4.2.2 - Соотношение частот генотипов соматотропина по MspI- и AluI – маркерам в анализируемых группах КРС. 1 – группа коров черно-пестрой породы, ОАО «Снежка-Госома; 2 – частный скот (Жирятинский р-н, Брянской области); 3 – группа коров айрширской породы, СПХ Сельцо.

3.5. Сравнение распространения аллелей гена соматотропина по MspI- и AluI – маркерам у КРС в Брянской области и других регионах.

В литературе отмечена крайне низкая частота Msp(-)-аллеля у северо-европейских пород КРС. Наивысшая частота этого аллеля наблюдается у зебу [Lagziel et al., 2000]. Возможно, это является одной из причин высокой жирности молока зебу. Эта особенность сделала зебу ценным материалом для гибридизации и выведения новых жирномолочных пород крупного рогатого скота. Жирномолочность гибридных коров, обусловленная наследственным влиянием зебу, оказалась наивысшей и составила 4,15 %, что на 0,58–0,32 % больше, чем у чистопородных сверстниц [Караев Г. С., 2009]. Преобладание частоты Msp(-)-аллеля у зебу, может свидетельствовать о зебувидном происхождении этого аллеля [Keiko K. de M. et al., 2004]

Анализ литературных данных по частотам MspI(-)-аллеля, приведенных в таблице 3.5.1 позволяет условно выделить три группы.

В первую группу в основном входят европейские и североевропейские породы КРС, у них частота этого аллеля колеблется от 0,02 до 0,19. В эту же группу вошли анализированные нами стадо коров айрширской породы и частный беспородный скот.

Вторую группу составляют породы со средним значением часты MspI(-)-аллеля. В основном это породы украинской и русской селекции. Частота (-) аллеля в этой группе колеблется от 0,25 до 0,38. В эту группу попала проанализированная нами выборка коров черно-пестрой породы.

Особую группу составляют зебу и монгольский як. Частота MspI(-)-аллеля в ней достигает 0,94.

Таблица 3.5.1

Сравнение частот аллеля (-) и V - аллелей гена соматотропина по MspI-и AluI-маркерам.

При сопоставлении частот аллелей MspI(-)- и V-аллелей определяемых двумя мутациями расположенными в разных частях гена, было обнаружено, что в породах с максимальной частотой MspI(-)-аллеля частота V-аллелей минимальна и наоборот. Так в стаде зебувидного скота с частотой MspI(-)-аллеля 0,94 аллель V отсутствует, а у ярославской породы при частоте MspI(-)-аллеля – 0,02, частота V-аллель соствляет 0,56). Эта зависимость подтвердилась при корреляционном анализе (коэф. коррел.=-0,65).

Рис. 3.5.1 - Соотношение частот аллелей соматотропина по MspI- и AluI-маркерам в анализированных группах КРС. 1 – группа коров черно-пестрой породы, ОАО «Снежка-Госома; 2 – частный скот (Жирятинский р-н, Брянской области); 3 – группа коров айрширской породы, СПХ Сельцо.

Аналогичная зависимость прослеживается при сравнении частот (-) и V - аллелей в трёх анализируемых нами группах КРС, значение коэффициента корреляции составило -0,80. На рисунке 3.5.1 приведена гистограмма с соотношением аллелей гормона роста по обоим маркерам в анализируемых группах КРС. Линии тренда проходящие по вершинам столбцов с частотами (+) и V-аллелей в анализируемых группах КРС практически параллельны.

Таким образом, при отборе Msp(-)-аллеля, с которым ассоциированы высокая жирность молока, в стаде может происходить обеднение V-аллелем, также благоприятным с хозяйственной точки зрения и наоборот.

3.6. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина (βLG).

Идентификацию аллельного полиморфизма βLG по точечной замене в нуклеотидной последовательности в экзоне 4 предложил Medrano, et al. 1990 год. Эта мутация предполагает появление дополнительного сайта рестрикции для эндонуклеазы HaeIII и замене в пептидной последовательности аминокислоты Val на Ala для В варианта в положении 118.

Другая методика, определения аллелей А, В была разработана Гладырь [Гладырь и др.,2001]. По этой методике вариант В определяется по мутации второго основания триплета G A T>G G T во втором экзоне, приводящего к замене аминокислоты в положении 64.

По методике Medrano, et al., 1990 амплифицировали фрагмент ДНК включающий участок 4 интрона и 4 экзона 247 п.о. Вариант В от А отличается наличием дополнительного сайта для рестриктазы HaeIII. После обработки продуктов ПЦР этой рестриктазой появляются специфичные для этих аллелей фрагменты: 148 и 99п.о. – для А варианта и 99, 74 и74 п.о. для В варианта. На рисунке 3.6.1. показана электрофореграмма фрагментов ДНК после рестрикции эндонуклеазой HaeIII.

По методике (Гладырь и др., 2001) амплифицировали фрагмент длиной 1248 п.о. После рестрикции по сайтам PvuII наблюдали появление специфичных фрагментов длиной 774 и 474 п.о. соответствующих аллелю А. Точковая мутация в нуклеотидной последовательности варианта В обуславливает образование дополнительно сайта рестрикции PvuII и приводит к появлению трёх специфичных для аллеля В фрагментов длиной 774, 297 и 177 п.о. Фрагменты с длинами соответствующие аллелю D выявлены не были. Рестрикция PstI позволяет определять аллель С. В анализируемых образцах вариант C также обнаружен не был. Пример определения варианта гена бета-лактоглобулина по этой методике приведен на рисунке 3.6.2.

Выявление аллельных вариантов гена βLG мы проводили по двум выше представленным методикам, в основе которых лежит анализ точечных нуклеотидных замен в экзонах 2 и 4.

При анализе полиморфизма бета-лактоглобулина с разной частотой были выявлены три генотипа. Результаты анализа генетической структуры изучаемых групп КРС и частоты несовпадений в определении генотипов по описанным методикам указаны в таблице 3.6.1. При оценке полиморфизма гена бета-лактоглобулина в исследуемых группах КРС в разной степени наблюдается преобладание В-аллеля, максимальная частота этого аллеля зафиксирована в группе коров айрширской породы, там она достигает 77%. В этой же группе отмечена наивысшая частота АА-генотипа. Иная картина наблюдается в группах коров черно-пестрой породы и частного скота. В этих группах чаше всего встречались животные с гетерозиготным генотипом. В выборке частного скота отмечены приближенные значения частот А – и В – генотипов. Наглядно соотношение частот генотипов гена β – лактоглобулина в исследуемых группах КРС представлено на рисунке 3.6.3.

Во всех анализируемых группах крупного рогатого скота выявленные частоты аллелей достоверно не отклонятся от теоретически рассчитанных.

Рис. 3.6.1 - Электрофоретический анализ продуктов рестрикции, при определении генотипа β – лактоглобулина по методике Medrano, et al., 1990. 1 – маркер молекулярных масс М27 (СибЭнзим); Генотипы образцов 2-6 указаны на фотографии

Рис 3.6.2 - Электрофоретический анализ продуктов рестрикции, при определении генотипа β – лактоглобулина по методике Гладырь и др., 2001. 1 – маркер молекулярных масс М27 (СибЭнзим); Генотипы образцов 2-7 указаны на фотографии

Таблица 3.6.1