ВВЕДЕНИЕ. QTL (ЛКП) – локус количественных признаков

Список сокращений

QTL (ЛКП) – локус количественных признаков

CSN3 – ген каппа-казеина

βLG – ген бета-лактоглобулина

PRL – ген пролактина

PIT – ген гипофизарного фактора транскрипции

GH – ген соматотропина

GH/Alu –аллельные варианты гена соматотропина по Alu-маркеру

GH/MspI - аллельные варианты гена соматотропина по MspI-маркеру

ПЦР – полимеразная цепная реакция

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11

1.1. Молекуляно-генетический анализ количественных признаков 11

1.2 Подходы для выявления аллельного полиморфизма 15

1.3. Характеристика генов основных белков молока 24

1.3.1. Каппа-казеины молока 25

1.3.2. Бета-лактоголобулин 29

1.3.3. Альфа-лактальбумин 30

1.4. Характеристика генов гормонов, влияющих на параметры молочной продуктивности 31

1.4.1. Соматотропин (GH) 31

1.4.2. Пролактин 34

1.5. Гипофизарный фактор транскрипции (PIT-1) 38

2. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41

2.1. Выделение ДНК из крови 42

2.2. Определение белка в молоке 42

2.3. Анализ полиморфизма гена каппа-казеина (CSN3) 44

2.4. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина 45

2.4.1. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Medrano, et al., 1990 г. 45

2.4.2. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Гладырь Е.А., 2001г. 46

2.5. Анализ полиморфизма гена соматотропина по MspI-маркеру (GH/MspI) 46

2.6. Анализ полиморфизма гена соматотропина по AluI-маркеру (GH/AluI) 47

2.7. Анализ полиморфизма гена пролактина (PRL) 48

2.8. Анализ полиморфизма гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) 48

2.9. Статистическая обработка результатов 49

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50

3.1. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену каппа-казеина (CSN3) 50

3.2. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену пролактина (PRL) 53

3.3. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену гипофизарного фактора транскрипции (PIT-I) 58

3.4. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену соматотропина (GH) 62

3.4.1. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по MspI-маркеру гена соматотропина 62

3.4.2. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по AluI-маркеру гена соматотропина 65

3.5. Сравнение распространения аллелей гена соматотропина по MspI- и AluI – маркерам у КРС в Брянской области и других регионах 68

3.6. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина (βLG) 71

3.7. Анализ сочетания мутаций при определении А и В аллелей гена β- лактоглобулина 77

3.8. Определение гетерозиготности в изучаемых группах крупного рогатого

скота 81

3.9. Оценка состава комплексных генотипов в исследуемых группах КРС 84

4.0. Анализ влияния аллельных вариантов исследуемых генов на показатели молочной продуктивности КРС 86

4.1.1. Изучение связи генотипов бета-лактоглобулина с параметрами молочной продуктивности КРС 87

4.1.2. Определение влияния аллельных вариантов гена соматотропина по MspI-маркеру на параметры молочной продуктивности КРС 89

4.1.3. Анализ связи аллельных вариантов гена соматотропина по AluI-маркеру с параметрами молочной продуктивности КРС 91

4.1.4. Комплексное влияние вариантов гена соматотропина по AluI- и MspI - маркерам на молочную продуктивность 93

4.1.5. Анализ связи аллельных вариантов гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) с параметрами молочной продуктивности КРС 94

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ

Молочное скотоводство стремится к достижению положительных результатов в вопросах как увеличения производства молока, так и улучшения его качества.

Традиционно сложившаяся система отбора племенных животных, к сожалению, не учитывает их генотипичесую индивидуальность, отражающую уровень и направление процессов, протекающих в организме [Кудрин А.Г. 2006].

В основе современной селекции животных лежит отбор по комплексу признаков. Животные, сочетающие желательные качества, считаются наиболее ценными в племенном отношении. Цели, намеченные селекционером, можно достичь, зная биологическую природу высокой продуктивности, рассматривая организм животного как целое.

Молочное скотоводство является одной из важнейших отраслей сельского хозяйства нашей страны. За последние пять лет объемы производства молока сократились на треть. В 2005 году производство молока в хозяйствах всех категорий сократилось на 1028 тысяч тонн по сравнению с 2004 [Лях В.Я. 2008]. Это связано с сокращением численности животных и пород (с 25 млн. до 13 млн. голов) и снижением их продуктивности. При этом возросла доля импортной продукции [Вагапова О.А., 2006]. Из 66 пород КРС, разводившихся в 80-90 годах XX века в СССР на 2001 год в Российской Федерации осталось только 33 породы, из них только 16 имеют достаточную численность для нормального воспроизводства [Алтухов и др., 2004].

На 2006 год производство молока в Брянской области сократилось на 61,7 тысяч тонн по сравнению с 2004 годом [Лях В.Я. 2008]. Расчеты показывают, что в 2005 году только в 20 регионах страны объем производства молока на сельскохозяйственных предприятиях превысил объемы переработки на предприятиях молочной отрасли. Среди этих регионов Брянской области нет.

Несмотря на успехи молочного животноводства в странах Европы и Северной Америки, наблюдаются серьезные проблемы, связанные с резким преобладанием в животноводческих хозяйствах голштинской породы КРС. Это привело к значительному сокращению численности других пород, и к сокращению общего генетического разнообразия генофонда КРС. Обеднение генофонда КРС в будущем может привести к отрицательным непредсказуемым последствиям.

Аналогичный процесс идет и в России: на 01.01.2004 г. в Российской Федерации зарегистрированы 33 породы КРС, в том числе 24 молочного и 9 – мясного направления [Столповский Ю.А., Захаров И.А., 2006]. Стало неэффективным разводить многочисленные локальные породы, и они интенсивно поглощаются современными многозональными породами [Эрнст Л.К., 2008].

В последние годы в нашей стране проводится массовая голштинизация крупного рогатого скота отечественных пород, зачастую без достаточного изучения влияния скрещивания на качество молока и молочных продуктов. Вагапова О.А. отмечает, что с увеличением доли кровности по голштинской породе повышается требовательность животных к условиям кормления и содержания. В связи с «затруднительным» положение многих хозяйств такие животные в полной мере не раскрывают свой потенциал [Вагапова О.А., 2006].

Повышение рентабельности молочного скотоводства, ускорение темпов совершенствования племенных и продуктивных качеств животных вызывает необходимость более раннего прогнозирования продуктивности. Требуются надежные, достоверные приемы прогноза, которые имели бы хорошую повторяемость и достаточно высокую наследуемость. Выполнение этих условий вполне возможно при разработке и внедрении методов биотехнологии и изучении генетического потенциала КРС. Кольцов Н.К. в 1926 году отметил, что задача животновода состоит, прежде всего в том, чтобы изучить породы с генетической стороны, оценить их наследственные достоинства и недостатки [Кольцов Н.А., 1926].

Для повышения генетического потенциала молочной продуктивности поголовья крупного рогатого скота в России и в Брянской области необходимы надежные критерии тестировании их генетической предрасположенности к высоким показателям молочной продуктивности.

В последнее время в селекционной работе активно идет поиск генов, которые можно использовать в качестве маркеров параметров молочной продуктивности.

Первоначально в качестве информационных критериев (маркеров) использовались морфологические (фенотипческие) признаки, однако количество маркеров этого типа ограничено и они имеют сложный характер наследования. Развитие молекулярной биологии и биотехнологии позволили создать новые тест-системы, позволяющие определять генетический полиморфизм на уровне генетического материала клетки [Сулимова Г.Е., 2006, Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006].

Использование ДНК-маркеров расширяет возможности селекционной работы и позволяет выявлять закономерности проявления признака у животного, независимо от внешних факторов. Селекция по генотипу способствует надежной идентификации животных по QTL и быстрому наращиванию предпочтительных аллелей с целью повышения продуктивности и устойчивости к заболеваниям улучшаемых пород животных.

Целью настоящей работы является анализ генетического полиморфизма коров в нескольких стадах КРС Брянской области по генам, определяющим молочную продуктивность и качество молока: каппа-казеина, β-лактоглобулина, пролактина, гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и гену соматотропина по AluI и MspI маркерам.

Задачи настоящего исследования:

· Генотипирование животных по локусам генов казеина (CSN), β-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL), гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и соматотропина (GH) по AluI и MspI маркерам;

· Определение частоты встречаемости аллельных вариантов и генотипов по анализируемым генам;

· Проведение сравнительного анализа распределения различных генотипов анализируемых генов в разных породах и группах;

· Оценка показателей молочной продуктивности (средний удой за месяц, процентное содержание жира и белка) у коров чёрно-пёстрой породы с различным сочетанием генотипов анализируемых генов;

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые на молекулярно-генетическом уровне охарактеризован генофонд стад коров черно-пестрой породы (Снежка-Госома), айрширской породы (Сельцо) и частного скота на территории Брянской области по ДНК-маркерам шести локусов, участвующих в формировании признака молочной продуктивности (гены казеина (CSN), β-лактоглобулина (βLG), пролактина (PRL), гена рилизинг-фактора (PIT-1) и соматотропина (GH) по AluI и MspI маркерам).

Проведение сравнительного анализа ДНК-полиморфизма по этим локусам показало, что некоторые аллели генов, обладающие благоприятным влиянием на показатели молочной продуктивности встречаются редко или исчезли в анализируемых группах животных, например, В-аллель гена каппа-казеина. В чистопородных стадах, по сравнению с группой частного скота, отмечен высокий уровень неравномерной гомозиготизации.

При анализе полиморфизма по гену бета-лактоглобулина было обнаружено нарушение сцепления между двумя мутациями, определяющими отличие А от В аллелей и обнаружены новые аллельные варианты, соответствующие А аллелю по локусу одной мутации и В аллелю по другой.

При изучении полиморфизма гена гормона роста по двум молекулярным маркерам, напротив, была выявлена значительная отрицательная корреляция (-0.8) частот встречаемости «-» аллеля по MspI-маркеру и L аллеля по AluI-маркеру гена гормона роста по трем изученным группам животных.

На примере конкретного сельскохозяйственного предприятия ОАО «Снежка-Госома» в производственном стаде коров черно-пестрой породы было продемонстрировано влияние аллельных вариантов генов бета-лактоглобулина, соматотропина и гипофизарного фактора на показатели молочной продуктивности. Наиболее выраженным действием на удои отличались аллельные варианты гена гормона роста, а самое сильное и достоверное влияние на содержание белка в молоке проявил ген бета-лактоглобулина.

Проведение оценки генетического потенциала молочной продуктивности крупного рогатого скота по генетическим маркерам позволит начать внедрение методов генетического анализа в практическое животноводство в племенных животноводческих хозяйствах Брянской области и существенно увеличить производство молока, а также продуктов его переработки.

По материалам диссертации опубликованы 5 научных работ. В том числе в журналах «Вестник БГУ» и «Вестник Самарского научного центра Российской академии наук» включенных в перечень рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Объем диссертации составляет 123 страницы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, выводов, предложений производству и списка литературы. Диссертация содержит 17 таблицы и 20 рисунков. Список использованной литературы включает 199 источников, в том числе 146 работ иностранных авторов.