Киров 2005

По учебной практике

Студентов 4 курса обучения

по специальности 012400 «Микробиология»

специализация 012405 «Биотехнология»

Экспериментальное производство колибактерина

Приготовление производственной культуры штамма E.coli М-17

Киров 2005

Составители:

к.б.н., Лауреат Государственной премии РФ Г.В.Комоско;

д.т.н. А.А.Лещенко

В подготовке материалов принимали участие:

с.н.с. А.З.Хонин;

м.н.с. Е.И.Полищук

Рецензенты:

к.м.н., с.н.с. Лауреат премии Правительства РФ А.Н.Шевцов, начальник научного отдела НИИ микробиологии МО РФ;

к.т.н., с.н.с. С.С.Анкер, руководитель лаборатории госконтроля качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

Колибактерин сухой представляет собой микробную массу живых колибацилл, лиофилизированных с добавлением одной из защитных сред: сахарозо-желатиновой или сахарозо-крахмальной.

Выпускается в сухом виде в ампулах или флаконах.

Препарат в ампулах или флаконах - кристаллическая или пористая масса желтовато-бежевого цвета.

Лечебный эффект препарата обусловлен антагонистическим действием микробных клеток колибацилл по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Колибактерин сухой предназначен для лечения детей и взрослых, страдающих хроническими колитами различной этиологии, в том числе неспецифическими язвенными колитами, осложненными дисбактериозами, возникшими в результате применения антибиотиков, сульфаниламидных препаратов и других причин.

Специальным сырьем для приготовления колибактерина сухого является маточная культура производственного штамма Е. coli M-17 и питательные среды.

Схема

процесса производства колибактерина

Рисунок

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Эталонная культура штамма E.coli М-17 – образец (эталон) микробной культуры штамма М-17, обладающий совокупностью присущих только ему свойств, находящийся в лиофильно высушенном виде в запаянной стеклянной ампуле. Эталонную культуру предприятие – изготовитель колибактерина получает из Государственного института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.

Производственная культура штамма E.coli М-17 – микробная культура штамма М-17, обладающая совокупностью присущих только ему свойств, полученная при размножении штамма в производственной лаборатории, находящаяся в лиофильно высушенном виде в запаянных стеклянных ампулах. Производственную культуру готовят в необходимом количестве ампул с целью постоянного обеспечения технологического процесса производства колибактерина.

СХЕМА

приготовления производственной культуры штамма E.coli М-17

ОПИСАНИЕ ПРОЦЕССА ПРИГОТОВЛЕНИЯ

ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ КУЛЬТУРЫ ШТАММА E.COLI М-17

Производственный штамм E.coli М-17 принадлежит к виду Escherichia coli семейства Enterobacteriaceae.

Ампулу с эталонным штаммом E.coli М-17, полученную из ГИСК им. Л.А.Тарасевича, протирают ватой, смоченной 70º этиловым спиртом, а затем в стерильных условиях вскрывают. Во вскрытую ампулу стерильно вносят 1,0 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида (физиологический раствор) или 1,0 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) (рН 7,2-7,6). Регидратированную культуру пипеткой переносят в пробирку с 5,0 мл мясо-пептонного бульона и тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем культуру в пробирке инкубируют в термостате при температуре 37±1ºС в течение 1,5-2 часов. По истечении указанного времени из пробирки по 0,5 мл производят высевы на чашки Петри с 1,5-2%-ным мясо-пептонным агаром (МПА), покачивая чашки культуру равномерно распределяют по поверхности агара. Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 37±1ºС и инкубируют 12-18 часов. По окончании срока инкубирования изучают выросшие отдельные колонии штамма под лупой. Отбирают микробиологической петлей типичные колонии с ровными краями круглые выпуклые матовые. По 5-10 колоний засевают в пробирки с 5 мл мясо-пептонного бульона. Пробирки тщательно встряхивают и выдерживают при температуре 37±1ºС в течение 1,5-2 часов, после чего из этих пробирок по 0,2-0,3 мл пипеткой делают посевы на скошенный в пробирках 1,5-2%-ный мясо-пептонный агар, равномерно распределяя культуру по его поверхности. Культуру на скошенном в пробирках агаре выращивают в течение 16-18 часов при температуре 37±1ºС, после чего выросший газон культуры визуально изучают, исключая из дальнейшей работы пробирки с подозрением на наличие посторонней микрофлоры. В пробирки с качественной культурой вносят по 2,0-3,0 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида или мясо-пептонного бульона и пипеткой смывают культуру с поверхности агара. После чего полученной суспензией клеток засевают флаконы вместимостью 100 мл, содержащие по 50,0 мл мясо-пептонного бульона. С одной пробирки засевают один флакон. Посевы выдерживают при температуре 37±1ºС в течение 1,5-2 часов, после чего из флаконов культуру пересевают на дрожжевой или мясо-пептонный 3-4%-ный агар, скошенный в матрацах. На один матрац засевают по 5,0 мл бульонной культуры из флаконов.

Культуру штамма в матрацах инкубируют при 37±1ºС в течение 12-18 часов. По окончании инкубации культуру в матрацах визуально оценивают с целью исключения колоний посторонней микрофлоры и возможных зон фаголизиса. Матрацы с подобными явлениями бракуют. В матрацы с качественным газоном микробов на поверхности питательного агара вводят по 10 мл стерильной среды высушивания, содержащей 10% сахарозы и 1% желатина, а также 20-30 штук стерильных стеклянных бус или стерильного гравия. Производят смыв культуры с поверхности агара. После смыва культуры суспензии клеток из матрацев отбирают пипеткой объемом 10 мл в стерильную емкость (флакон) и тщательно перемешивают. Объединенную суспензию микробных клеток с помощью медицинского шприца и длинной иглы фасуют по 1 мл в стерильные ампулы объемом 6 мл. Культуру в ампулах подвергают лиофильному высушиванию.

Приготовленную производственную культуру до высушивания и сразу после высушивания оценивают по культуральным, морфологическим, биохимическим, антагонистическим, серологическим свойствам; контролируют отсутствие посторонней микрофлоры и количество живых микробных клеток в 1 мл.

Культуральные и морфологические свойства. Штамм E.coli М-17 является аэробом, хорошо растет на простых питательных средах. Представляет собой подвижные грамотрицательные короткие палочки с закругленными концами. На мясо-пептонном агаре через 12-18 часов клетки штамма образуют круглые, с ровными краями, мутноватые, выпуклые колонии. При выращивании в мясо-пептонном бульоне через 2-4 часа происходит равномерное помутнение среды. На среде Эндо клетки образуют розовые колонии с металлическим блеском. Оптимальная температура роста микроба 36-37ºС (Приложение 1).

Контроль на отсутствие посторонней микрофлоры. Наличие в мазке, окрашенном по Грамму, отличающихся по размерам, форме и окраске клеток от микробов E.coli, а также присутствие на мясо-пептонном агаре в чашках Петри нехарактерных для штамма E.coli М-17 колоний, говорит о загрязнении производственной культуры посторонней микрофлорой (ПМФ). При наличии ПМФ серию производственной культуры бракуют и начинают процесс с начала (Приложение 2).

Биохимические свойства. Микробные клетки штамма E.coli М-17 расщепляют (утилизируют) с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, манит, мальтозу, сахарозу; желатин не разжижает; образует индол (Приложение 3).

Серологические свойства. Штамм E.coli М-17 имеет следующую антигенную формулу: О₂:L₁:H₆ и агглютинируется специфической сывороткой до ½ титра (при титре сыворотки не ниже, чем 1:6400) (Приложение 4).

Антагонистические свойства. Штамм E.coli М-17 обладает антагонистической активностью в отношении шигелл и ряда других патогенных и условно патогенных микроорганизмов кишечной группы. Антагонистическую активность производственного штамма оценивают в смешанных культурах по отношению к двум штаммам шигелл Флекснера и одному - двум штаммам шигелл Зонне. Антагонистический показатель по отношению к тест-штаммам шигелл Флекснера должен быть не ниже 60, а по отношению к тест-штаммам шигелл Зонне – не ниже 30 (Приложение 5).

Количество живых микробных клеток в производственной культуре. В 1 см³ регидратированной в ампуле производственной культуры должно содержаться не менее 5 ^. 10⁹ живых микробных клеток штамма E.coli М-17. Определение проводят путем последовательных десятикратных разведений культуры в пробирках с 0,9 %-ным раствором натрия хлорида (к 0,5 см³ культуры добавляют 4,5 см³ 0,9 %-ного раствора натрия хлорида) до 10^-8. Из двух последних пробирок с разведениями 10^-7 и 10^-8 производят пипеткой высевы по 0,1 см³ на МПА в чашках Петри (по 5 чашек каждого разведения). Инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) ⁰С в течение 16-18 ч. По окончании инкубации подсчитывают количество колоний на чашках, определяют среднюю арифметическую величину и рассчитывают, учитывая произведенные разведения культуры, количество живых микробных клеток в 1 см³ производственной культуры.

Вновь приготовленная серия производственной культуры штамма E.coli М-17 должна иметь порядковый номер, который наносят на каждую ампулу и на коробки, в которых хранятся ампулы. Сведения о каждой серии производственной культуры, отражающие его свойства, заносят в специальный журнал, в котором также ведут расход культуры.

Производственная культура штамма E.coli М-17 должна храниться при температуре 5±1ºС в специально отведенном запираемом и опечатанном холодильнике.

2. СОДЕРЖАНИЕ ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ

Цели занятия

1. Изучить порядок приготовления производственной культуры штамма E.coli М-17.

2. Изучить биологические свойства штамма E.coli М-17.

3. Познакомиться с порядком приготовления питательных сред, дополнительных растворов, среды высушивания в процессе подготовки производственной культуры штамма E.coli М-17.

4. Освоить процесс приготовления производственной культуры штамма E.coli М-17 и оценку ее биологических свойств.

Сырье, материалы, реактивы и оборудование

Эталонная микробная культура производственного штамма E.coli М-17, лиофилизированная в ампуле, паспорт ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Сырье:

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709

Мясо – говядина и телятина, ГОСТ 779

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей, ГОСТ 13805

Натрий хлористый хч, чда, ГОСТ 4233

Агар микробиологический высш. сорт, ГОСТ 17206

Натр едкий технический, ТУ 6-01-1306

Дрожжи хлебопекарные прессованные, ТУ 9182-005-00353595

Железы поджелудочные КРС, ГОСТ 11285 или панкреатин технический, ОСТ 49067

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный хч, чда, ГОСТ 4172

Натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный хч, чда, ГОСТ 11773

Хлороформ технический, ГОСТ 20015 или хлороформ медицинский, ГФ изд. Х-68, ст. 601

Сахароза хч, чда, ГОСТ 5833

Натрий углекислый кислый, ГОСТ 4201, хч или натрий двууглекислый (сода пищевая), ГОСТ 2156

Крахмал картофельный, ГОСТ 7699

Желатин пищевой, 1 сорт, ГОСТ 11293

Водорода перекись, ГОСТ 10929

Реактивы:

Натрия гидроокись хч, чда, ГОСТ 4328

Формалин технический, ГОСТ 1625 или формалин медицинский, ГФ изд. Х-68, ст. 619

Фенолфталеин (индикатор), ч, ТУ 6-09-5360

Нейтральный красный (индикатор), чда, ТУ 6-09-4120

Кислота щавелевая, стандарт-титр, 0,1 Н раствор, ТУ 6-09-2540

Калий хлористый хч, чда, ГОСТ 4234

Стандарт-титры для приготовления образцовых буферных растворов для рН-метрии 2-го разряда, ГОСТ 8.135

Йод кристаллический, чда, хч, ГОСТ 4159

Калий йодистый, чда, ч, хч, ГОСТ 4232

Масло иммерсионное для микроскопии, ГОСТ 13739

Метиловый красный (индикатор), ТУ 6-09-40-70-75

Метиловый фиолетовый (индикатор), ТУ 6-09-945-76

Спирт этиловый ректификованный, ГОСТ 5962

Фенолфталеин (индикатор), ГОСТ 5850

Фуксин основной, ТУ 6-09-3804

Посуда:

Пробирки исп. П1 и П2, ГОСТ 25336

Чашки биологические (Петри), ГОСТ 25336

Матрацы стеклянные вместимостью 1,5 дм³, ТУ 64-2-181

Флаконы вместимостью 100 см³, ТУ 64-2-100

Воронки стеклянные, ГОСТ 25336

Колбы мерные лабораторные, стеклянные, вместимостью 1000 см³, ГОСТ 1770

Стаканы стеклянные лабораторные с "носиком", тип В1, вместимостью 50, 100, 200, 400, 600, 1000 см³, ГОСТ 25336

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250, 500, 1000 см³, ГОСТ 1770

Палочки стеклянные лабораторного изготовления

Шпатели стеклянные лабораторного изготовления

Бусы стеклянные лабораторного изготовления

Бюретка стеклянная без крана вместимостью 25 см³, ГОСТ 20292-74Е или СТ СЭВ 1247

Пипетки мерные лабораторные вместимостью 1, 2, 5, 10 см³, тип 1 и 2, ГОСТ 20292

Бутыли вместимостью 1, 5, 10, 15 дм³

Колбы конические лабораторные стеклянные вместимостью 100 см³, ГОСТ 25336

Ампулы стеклянные вместимостью 6 см³, ТУ 64-2-10-87

Материалы:

Вата медицинская гигроскопическая, ГОСТ 5556

Марля медицинская, ГОСТ 9412

Бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026

Пробки ватно-марлевые лабораторного изготовления

Кастрюли из нержавеющей стали или эмалированные вместимостью 3, 5, 10 дм³

Термометры ртутные стеклянные лабораторные с пределами измерений 0…100ºС, ГОСТ 215

Оборудование:

Мясорубка бытовая

Иономер универсальный или рН-метр тип И-75, И-130, рН-673, рН-150, рН-150М, ТУ 25-05-2147

Весы лабораторные электронные, модель ВЛЭ 134М, ТУ 25-7713.0031 или аналогичные

Электроплитка бытовая, тип ПЭК 800/3, ГОСТ 14919

Термостат электрический суховоздушный, ТУ 9452-02-00141798 или аналогичный

Баня водяная, ТУ 46-22-608

Автоклав, ГОСТ 14106

Микроскоп световой биологический, ГОСТ 8284

Стерилизатор медицинский, ГОСТ 27437

Шприцы медицинские объемом 1 и 2 см³

ХОД РАБОТЫ

1. Приготовление питательных сред, дополнительных растворов и среды высушивания

Процесс приготовления питательных сред, дополнительных растворов и среды высушивания, которые необходимы для получения серии производственной культуры штамма E.coli М-17, изложен в "Методических указаниях".

Экспериментальное производство колибактерина. Стадия 2. Получение нативной микробной взвеси при глубинном методе культивирования. Этап. Приготовление питательных сред.

Работа 1. Приготовление мясо-пептонного бульона

Первым этапом приготовления мясо-пептонного бульона является приготовление мясной воды.

Мясо крупного рогатого скота освободить от костей, жира и сухожилий, приготовить фарш. Навеску фарша массой 500 г залить 1 дм³ дистиллированной воды, перемешать и поставить настаиваться в течение суток в прохладном месте. Замерить объем смеси. Затем настой вместе с мясом при помешивании прокипятить в течение 1 часа. Вновь замерить объем и подвести его до первоначального дистиллированной водой. После этого перемешать и профильтровать через бумажный фильтр. Разлить в соответствующую стеклянную тару и простерилизовать в автоклаве при температуре (120±2)°С в течение 30 минут.

К 500 см³ мясной воды добавить 500 см³ дистиллированной воды, 10 г сухого пептона и 5 г натрия хлористого. Смесь подогреть на электрической плитке при помешивании до растворения компонентов. Откорректировать величину рН среды до значений рН 7,2...7,6 ед. рН, используя 20%-ный раствор гидроокиси натрия. Среду прокипятить 5... 10 минут, профильтровать через бумажный фильтр, разлить в стеклянную тару и простерилизовать в автоклаве при температуре (120±2)°С в течение 30 минут.

Работа 2. Приготовление мясо-пептонного агара

К 1,0 дм³ мясо-пептонного бульона добавить 15...20 г агара. Агар расплавить, поместив посуду со средой в автоклав и обработав ее текучим паром или нагреванием на водяной бане, постоянно помешивая. После расплавления агара установить величину рН среды в значениях 7,2...7,6 ед. рН, используя 20%-ный раствор едкого натра. Профильтровать через марлевый фильтр (три слоя медицинской марли), разлить в соответствующую стеклянную тару и простерилизовать в автоклаве при температуре (120±2)°С в течение 30 минут.

Работа 3. Приготовление дрожжевого агара

Для приготовления дрожжевого агара предварительно готовят дрожжевой автолизат.

Приготовление дрожжевого автолизата

Навеску прессованных хлебопекарных дрожжей массой 2 кг измельчить (нарезать кусочками), поместить в стеклянную бутыль вместимостью 10 дм³. Открытую бутыль с дрожжами (без добавления воды) поставить в термостат и выдержать при температуре 53...56ºС в течение 2...3 суток, перемешивая 5...6 раз в сутки. Затем в бутыль с жидкостью, которая образовалась при автолизе, добавить 3 дм³ подогретой до температуры (45±2)ºС водопроводной воды. Содержимое бутыли перемешать и простерилизовать в автоклаве при температуре (120±2)ºС в течение 30 минут.

Для приготовления дрожжевого агара к 1 дм³ надосадочной жидкости стерильного дрожжевого автолизата добавить 0,1 дм³ дистиллированной воды, откорректировать величину рН смеси до значений (7,4±0,1) ед. рН 20%-ным раствором едкого натра. Далее добавить 30 г агара, смесь расплавить в автоклаве текучим паром или при нагревании на водяной бане, постоянно помешивая. После расплавления агара повторно проконтролировать величину рН среды и при необходимости откорректировать величину рН до значения (7,4±0,1) ед. рН, используя 20%-ный раствор едкого натра. Среду разлить в матрацы по 300 см³, простерилизовать в автоклаве при температуре (120±2)°С в течение 30 минут и скосить.

Работа 4. Приготовление сахарозо-желатиновой среды

В 1 дм³ дистиллированной воды откорректировать величину рН до значения 7,0...7,1 ед. рН 20%-ным раствором гидроокиси натрия.

Навеску желатина массой 10 г залить 500 см³ дистиллированной воды с рН 7,0...7,1 ед. рН и оставить для набухания на 1...2 часа. Затем смесь нагреть при постоянном помешивании до кипения на водяной бане.

Навеску сахарозы массой 100 г залить 400 см³ дистиллированной воды с рН 7,0...7,1 ед. рН. Раствор подогреть на электрической плитке при помешивании до растворения сахарозы.

Полученные растворы желатина и сахарозы объединить и довести объем среды до 1 дм³, используя дистиллированную воду с рН 7,0..7,1 ед. рН. Полученный раствор перемешать и откорректировать величину рН до значения 7,0...7,1 ед. рН, используя 20%-ный раствор гидроокиси натрия. Готовую среду профильтровать через марлевый фильтр, разлить в стеклянную тару и простерилизовать в автоклаве при температуре (110±2)°С в течение 30 минут.

2. Приготовление производственной культуры штамма Е. coli M-17

Работа 5. Подготовка эталонной культуры к пересевам, высев на чашки Петри с мясо-пептонным агаром

Ампулу с эталонным штаммом Е. coli M-17 протереть ватным тампоном, обильно смоченным 70º этиловым спиртом. После испарения спирта с поверхности ампулы шейку ампулы нагреть на спиртовке и нанести на раскаленное место каплю охлажденной стерильной дистиллированной воды. Стекло ампулы в ее шейке треснет. Обернуть шейку ампулы стерильным марлевым тампоном и обломить. Ампула с эталонной культурой вскрыта. Во вскрытую ампулу пипеткой объемом 1,0 мл ввести стерильно 1,0 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Дать культуре регидратироваться при осторожном перемешивании кончиком пипетки. Через 3-5 минут регидратированную культуру стерильно у пламени спиртовки пипеткой перенести в пробирку с 5,0 мл мясо-пептонного бульона. Тщательно перемешать содержимое пробирки, осторожно встряхивая ее. Культуру штамма Е. coli M-17 в пробирке выдержать 1,5-2 часа при температуре 37±1ºС. По истечении указанного времени из пробирки пипеткой объемом 1,0 мл по 0,5 мл высеять на 1,5-2%-ный мясо-пептонный агар в чашках Петри и покачивая чашки распределить равномерно по поверхности агара. Чашки Петри с посевами помещают на 12-18 часов в термостат с температурой 37±1ºС.

Работа 6. Выращивание культуры штамма Е. coli M-17 на мясо-пептонном агаре, скошенном в пробирках

Через 12-18 часов чашки Петри с посевами достать из термостата и подвергнуть тщательному визуальному изучению с помощью лупы. На поверхности агара должны быть типичные для штамма колонии с ровными краями, круглые, выпуклые, матовые. Если наблюдаются другие колонии, то такие чашки отбраковать. Микробиологической петлей стерильно у пламени спиртовки отобрать 5-10 типичных колоний и перенести их в пробирку с 5,0 мл мясо-пептонного бульона. Таких пробирок посеять 3-5 штук. Содержимое пробирок тщательно перемешать встряхиванием посевов и поместить в термостат с температурой 37±1ºС на 1,5-2 часа, после чего из этих пробирок пипеткой объемом 1,0 мл засеять по 0,2-0,3 мл 10-20 пробирок со скошенным в них 1,5-2%-ным мясо-пептонным агаром. Равномерно распределить посев по поверхности агара.

Пробирки с посевами культуры штамма Е. coli M-17 на скошенном агаре поместить для выращивания в термостат с температурой 37±1ºС на 16-18 часов.

Работа 7. Выращивание культуры штамма Е. coli M-17 на мясо-пептонном (дрожжевом) агаре, скошенном в матрацах

Через 16-18 часов инкубирования пробирки с посевами штамма Е. coli M-17 на скошенном агаре достать из термостата и тщательно изучить характер выросшего газона микробных клеток. Должен наблюдаться однородный матовый газон. Исключить из работы пробирки, подозрительные на присутствие посторонней микрофлоры. В пробирки с культурой штамма Е. coli M-17 внести по 2,0-3,0 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида или мясо-пептонного бульона и с помощью пипетки объемом 1-2 мл смыть культуру с поверхности агара.

Полученную суспензию клеток перенести пипеткой объемом 5,0 мл во флаконы емкостью 100,0 мл, содержащие по 50,0 мл мясо-пептонного бульона. Суспензию клеток (2,0-3,0 мл) из одной пробирки перенести в один флакон. Содержимое флаконов тщательно перемешать и поместить в термостат с температурой 37±1ºС на 1,5-2 часа. Через обозначенное время достать флаконы и пипеткой объемом 5,0 мл или 10,0 мл произвести посевы штамма Е. coli M-17 на 3-4%-ный мясо-пептонный (дрожжевой) агар, скошенный в матрацах. 5,0 мл культуры посеять на один матрац, покачивая последний равномерно распределить культуру по поверхности агара. Матрацы с посевами поместить на 12-18 часов в термостат с температурой 37±1ºС.

Работа 8. Смыв культуру штамма Е. coli M-17 с поверхности агара в матрацах, фасовка в ампулы, лиофильное высушивание

Подготовить стерильные ампулы объемом 6,0 мл. Ампулы тщательно промыть, просушить. Отверстие в шейке ампулы заткнуть ватой. Простерилизовать ампулы в автоклаве.

По окончании инкубации достать матрацы с культурой штамма Е. coli M-17 из термостата. Внимательно изучить газон микробной культуры. Исключить из работы матрацы с возможным загрязнением посторонней микрофлорой или зонами фаголизиса. В отобранные для дальнейшей работы матрацы (предварительно удалив из них стерильной пипеткой конденсат) ввести пипеткой объемом 10,0 мл по 10,0 в каждый матрац стерильной сахарозо-желатиновой среды высушивания, содержащей 10% сахарозы и 1% желатина. Также в каждый матрац с культурой ввести по 20-30 штук стерильных стеклянных бус или гравия, с помощью которых смыть культуру с поверхности агара. Пипеткой объемом 10,0 мл перенести суспензии клеток из матрацев в одну стерильную емкость (колба, флакон). Суспензию клеток (объединенную) тщательно перемешать. Стерильным шприцем по 1,0 мл суспензии клеток в среде высушивания у пламени спиртовки расфасовать в подготовленные стеклянные ампулы. Перед введением культуры ватку из отверстия шейки убрать, после введения ватку поместить назад. По окончании фасовки ампулы с культурой штамма Е. coli M-17 передать на установку лиофильного высушивания. Перед непосредственным процессом сушки ватки из отверстий ампул убрать.

Лиофильное высушивание произвести по режимам высушивания колибактерина. По окончании процесса сушки ампулы запаять на газовой или бензиновой горелки. На каждую ампулу наклеить этикетку с наименованием штамма, номером серии, датой приготовления культуры. Ампулы уложить в коробку, перекладывая ватой. Коробку поместить в холодильник.

Производственную культуру штамма Е. coli M-17 после приготовления оценивают по культуральным, морфологическим, биохимическим, антагонистическим, серологическим свойствам, на отсутствие посторонней микрофлоры, количеству живых микробных клеток в ампуле.

Производственная культура должна соответствовать показателям качества, изложенным в подразделе "Описание процесса подготовки производственной культуры штамма Е. coli M-17".

3. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ

Каждый сотрудник, работающий в лаборатории, обязан знать и беспрекословно выполнять правила внутреннего распорядка, правила техники безопасности и производственной санитарии, правила противопожарной техники безопасности:

1. К работе в лаборатории допускаются лица, прошедшие инструктаж и обучение безопасным методам работы.

2. Не входить в лабораторию в уличной одежде и обуви.

3. Перед началом работы надеть соответствующую спецодежду (халат, медицинская шапочка или косынка, тапочки). Иметь на рабочем месте и в случае необходимости использовать индивидуальные средства защиты органов дыхания, глаз, рук (марлевые повязки, "лепестки", очки из органического стекла, резиновые перчатки, передники, сапоги).

4. В лаборатории запрещается принимать пищу, пить, курить, перемещаться без надобности.

5. Запрещается выполнение работ, не связанных с производственным заданием и не предусмотренных рабочими инструкциями.

6. Перед началом работы убедиться в исправности оборудования, приборов, вентиляции, целостности стеклянной посуды.

7. Не держать на рабочем месте (на лабораторном столе) предметы, не используемые в работе (сумки, книги и т.д.), не загромождать проходы и подходы к средствам пожаротушения.

8. Емкости с реактивами, растворами, питательными средами, биологическими культурами должны быть подписаны.

9. При работе с прописью водорода (5%-ный раствор), используемой для дезинфекции культур и посуды, необходимо использовать защитные очки, резиновые перчатки.

10. Запрещается при работе с пипетками втягивать в них жидкость ртом, для этой процедуры используют резиновые груши.

11. Весь лабораторный инструмент и всю лабораторную посуду, бывшую в контакте с микробными культурами, дезинфицируют 5%-ным раствором перекиси водорода или подвергают автоклавированию.

12. Мойку лабораторной посуды следует производить с применением средств индивидуальной защиты (перчатки, очки, фартук, резиновые сапоги).

13. При переносе сосудов с горячей жидкостью необходимо пользоваться полотенцем или другими материалами. Сосуд при этом следует держать обеими руками: одной рукой за дно, другой – за горловину.

14. При работе с использованием электронагревательных приборов необходимо соблюдать правила противопожарной безопасности.

15. Работать на неисправном и на незаземленном электрооборудовании запрещается.

16. При замеченных неисправностях применяемого инструмента и оборудования или при возникновении аварийной обстановки необходимо:

прекратить работы и предупредить об опасности работающих рядом сотрудников;

оказать первую помощь пострадавшему;

немедленно сообщить о сложившейся ситуации руководителю работ.

17. По окончании работы в лаборатории сотрудник обязан:

привести в порядок свое рабочее место;

убрать микробные культуры, реактивы, материалы;

продезинфицировать использованную в работе посуду и инструмент (после дезинфекции посуду и инструмент вымыть и убрать на отведенные для них места);

отключить нагревательные приборы, перекрыть краны, подающие воду.

4. ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

1. Эталонная культура штамма.

2. Производственная рабочая культура штамма.

3. Питательные среды, необходимые для приготовления производственной культуры.

4. Посуда и рабочий инструмент, используемые в работе.

5. Стадии приготовления производственной культуры.

6. Показатели качества производственной культуры.

7. Использование производственной культуры, ее хранение и учет.

5. ЛИТЕРАТУРА ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

1. Регламент производства колибактерина сухого № 153-80. – М., 1980.

2. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – С.-Пб, 1995.

3. Егорова Т.А. Основы биотехнологии. – М., 2003.

4. Равилов А.З., Гильмутдинов Р.Я., Хусаинов М.Ш. Микробиологические среды. – Казань, 1999.

5. Бакулин М.К. Приготовление питательных сред и подготовка посуды для культивирования микроорганизмов. Виды питательных сред. – Киров, 1997.

6. Методы общей бактериологии. Т.1. – М., "Мир", 1983.

7. Пименева М.Н., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. – Изд-во МГУ, 1971.

Приложение 1

Методика определения

культуральных и морфологических свойств штамма Е. coli M-17

Производственную культуру штамма Е. coli M-17 во вскрытой в асептических условиях ампуле регидратируют 1,0 см³ 0,9 %-ного раствора натрия хлорида, а затем производят этим же раствором последовательные десятикратные разведения культуры (к 0,5 см³ культуры добавляют 4,5 см³ 0,9 %-ного раствора натрия хлорида) до 10^-8. Из пробирки с разведением 10^-8 производят пипеткой посевы по 0,1 см³ на МПА в чашки Петри и по 0,15…0,20 см³ в пробирки с 5,0 см³ МПБ. Инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) ⁰С в течение 16…18 ч.

По окончании инкубации на чашках с МПА клетки штамма Е. coli M-17 образуют круглые, с ровными краями, мутированные, выпуклые колонии.

При выращивании в пробирках с МПБ через 2…4часа появляются равномерное помутнение питательной среды.

Для контроля на отсутствие ферментативно измененных вариантов штамма Е. coli M-17 – лактозонегативных колоний производственную культуру высевают на среду Эндо. Коммерческая среда Эндо (ФС 42-350498) содержит: панкреатический гидролизат кильки – 11,5 % г/л, экстракт кормовых дрожжей – 0,86 г/л, лактозу – 12,9 г/л, фуксин основной – 0,22 г/л, сульфат натрия двузамещенный – 0,48 г/л, сульфит натрия – 0,83 г/л, хлорид натрия – 3,6 г/л, карбонат натрия – 0,01 г/л, агар – 9,6 г/л.

рН среды (7,3 ± 0,2) ед. рН. Регидратированную производственную культуру наносят на поверхность среды Эндо в чашках Петри петлей, чтобы получить изолированные колонии. Инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) ⁰С в течение 16…18 часов.

По окончании инкубации на среде Эндо клетки штамма образуют розовые колонии с металлическим блеском.

Приложение 2

Методика определения

отсутствия посторонних микроорганизмов и грибов

в производственной культуре Е. coli M-17

Из регидратированной в ампуле производственной культуры штамма Е. coli M-17 для определения посторонней микрофлоры готовят мазок. На предметное стекло наносят каплю исследуемой пробы и растирают круговыми движениями бактериологической петлей. Мазок подсушивают на воздухе и фиксируют над пламенем спиртовки. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, равный размеру мазка. На эту бумажку наливают раствор генцианвиолета на 1… 2 минуты. Краску с бумажкой удаляют и препарат 1…2 минуты обрабатывают раствором Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя смывают и на 0,5…1,0 минуты наливают этиловый спирт (или стекло с мазком погружают в стакан со спиртом). Мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают разведенным фуксином 1…2 минуты. После этого краску сливают, репарат промывают водой, высушивают и просматривают под микроскопом при масляной иммерсии (увеличение объектива 90х, окуляров 10х).

Необходимые красители для окраски по Грамму:

генцианвиолет: 10 см³ насыщенного спиртового раствора генцианвиолета смешивают с 90 см³ 5 %-ного раствора фенола (карболовой кислоты);

расвор Люголя: 1 г йода и 2 г йодистого калия растворяют в 300 см³ дистиллированной воды;

карболовый фуксин готовят аналогично карболовому генцианвиолету;

насыщенные спиртовые растворы генцианвиолета и фуксина: 1 г препарата растворяют в 10 см³ 96 %-ного спирта.

Микробные клетки штамма Е. coli M-17, окрашенные по грамму, под микроскопом выглядят в виде коротких грамотрицательных палочек с закругленными концами.

Наличие в мазке отличающихся по размерам, форме и окраске клеток от микробов Е. coli M-17 говорит о загрязнении производственной культуры посторонней микрофлорой (ПМФ).

Приложение 3

Методика определения

биохимических свойств микробных клеток штамма Е. coli M-17

Микробные клетки штамма Е. coli M-17 расщепляют (утилизируют) с образованием кислоты и газа лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу, сахарозу; желатин не разжижают; образуют индол.

Утилизацию глюкозы, лактозы, маннита, мальтозы и сахарозы клетками Е. coli M-17 определяют при выращивании микробов производственной культуры в (5,0 ± 0,5) см³ пептонной воды в пробирках соответственно с: 1 % глюкозы, 1 % лактозы, 1 % маннита, 1 % мальтозы, 1 % сахарозы и индикатором Андреде.

В пробирки со средой и углеводами вносят по 0,2…0,3 см³ исследуемой культуры.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) ⁰С в течение 12…18 часов. По окончании инкубации наблюдают изменение цвета среды в пробирках. Исходный цвет среды – желтый. Изменение цвета свидетельствует об утилизации углеводов.

Тест на протеолитическое разжижение проводят в пробирках с мясопептонным желатином (10 % желатина в МПБ). Тест основан на гидролизе протеазами микроорганизмов (коллагеназами) белков желатина с утратой его желирующей способности, сопровождающейся разжижением желатина. В пробирки с 5…6 см³ мясопептонного желатина микробиологической петлей производственную культуру (регидратированную) уколом засевают в среду, погружая петлю до дна пробирки. Посевы инкубируют при (37 ± 1) ⁰С в течение 12…18 часов. Оценивают результат. Микробные клетки штамма Е. coli M-17 желатин не разжижают.

Образование индола клетками Е. coli M-17 оценивают в тесте на утилизацию триптофана. Определение на индол проводят после выращивания регидратированной производственной культуры в течение 16…18 часов в МПБ, обогащенном триптофаном – 0,3 % (готовая среда имеет цвет бульона) с добавлением после культивирования при температуре (37 ± 1) ⁰С реактивов Эрлиха или Ковача.

В пробирки с 5 см³ МПБ с триптофаном засевают 0,2…0,3 см³ исследуемой культуры. После культивирования вносят 1…2 см³ реактивов. Определение также проводят с использованием полосок из фильтровальной бумаги, пропитанных реагентами. Появление в среде или на полосках бумаги красного окрашивания указывает на наличие индола.

Реактив Эрлиха:

парадиметиламинбензальдегид – 1,0 г,

спирт этиловый 96 % - 95,0 см³,

кислота соляная концентрированная – 20,0 см³.

Реактив Ковача:

парадиметиламинбензальдегид – 5,0 г,

спирт амиловый – 75,0 г,

кислота соляная концентрированная – 25,0 см³.

Парадиметиламинбензальдегид растворяют в спирте. Смешивают с кислотой. Оба реактива имеют желтый цвет.

Приложение 4

Методика определения

серологических свойств микробных клеток штамма Е. coli M-17

Культура производственного штамма Е. coli M-17 должна агглютинироваться в развернутой реакции в пробирках специфической сывороткой группы Е. coli M-17 на 3…4 креста не менее, чем до ½ титра (при значении титра не ниже. чем 1:6400) при отсутствии агглютинации в контроле.

Для постановки развернутой реакции агглютинации исследуемую производственную культуру штамма Е. coli M-17 регидратируют 0,9 %-ным раствором натрия хлорида и пипеткой или бактериологической петлей засевают поверхность скошенного МПА в пробирках. Полученную после инкубации при температуре (37 ± 1) ⁰С 18…20 ч культуру смывают 0,9 %-ным раствором натрия хлорида до мутности, соответствующей 10 единицам по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича и вносят по 1,0 см³ в пробирки, содержащие по 1,0 см³ последовательно двукратно разведенной (начиная с разведения 1: 100) специфической сыворотки 02 группы Е. coli.

Контролем служат пробирки, содержащие по 10 см³: сыворотки в разведении 1: 100; 0,9 %-ный раствор натрия хлорида; культуру, разведенную до мутности 10 единиц по ОСО мутности.

Все пробирки в штативе встряхивают 5…8 раз и помещают на 18…20 часов в термостат с температурой (37 ± 1) ⁰С.

Схема

постановки развернутой реакции агглютинации с целью идентификации штамма Е. coli M-17 (титр агглютинирующей сыворотки 1: 6400)

Результаты учитывают визуально по 4-крестной схеме:

- 4 креста (++++) полная агглютинация, большой осадок, полное просветление надосадочной жидкости;

- 3 креста (+++) неполная агглютинация, осадок такой же, надосадочная жидкость менее прозрачна;

- 2 креста (++) слабая агглютинация, осадок небольшой, надосадочная жидкость непрозрачна;

- 1 крест (+) следы агглютинации, осадок весьма малый, надосадочная жидкость непрозрачна;

- отрицательная реакция, осадка нет, взвесь остается равномерно мутной.

В контрольной пробирке с сывороткой не должно быть хлопьев, взвесь культуры в 0,9 %-ном растворе натрия хлорида должна сохранить гомогенный вид, а раствор натрия хлорида оставаться прозрачным. При агглютинации производственной культуры Е. coli M-17 ниже, чем до разведения ½ титра специфической сыворотки контроль следует повторить.

Приложение 5

Методика определения

антагонистической активности производственной культуры штамма Е. coli M-17

Антагонистическую активность производственной культуры штамма Е. coli M-17 оценивают в смешанных культурах по отношению к 2 штаммам шигелл Флекснера и 1…2 штаммам шигелл Зоне. Показатель антагонистической активности в отношении тест-штаммов шигелл Флекснера должен быть не ниже 60,0, в отношении шигелл Зоне – не ниже 30,0.

Для определения антагонистической активности производственную культуру в ампулах регидратируют 0,9 %-ным раствором натрия хлорида. Из полученной взвеси производят посев петлей на поверхность скошенного в пробирке МПА и инкубируют при температуре (37 ± 1) ⁰С в течение 18 часов. Таким же образом засевают тест-микробы.

18 часовую культуру Е. coli M-17, а также культуры тест-микробов смывают с поверхности МПА 0,9 %-ным раствором натрия хлорида и разводят до концентраций 10 единиц по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

В пробирки с 5,0 см³ МПБ вносят пипеткой по 1,0 см³ суспензии каждого тест-штамма (в одну пробирку засевают один штамм).

В пробирки с тест-штаммами шигелл Флекснера вносят суспензию Е. coli M-17 в объеме 0,1 см³, а в пробирки с тест-штаммами шигелл Зоне – по 0,5 см³. Смешанные культуры инкубируют при температуре (37 ± 1) ⁰С с тест-штаммами Флекснера – 24 часа, с тест-штаммами Зоне-48 часов.

Через указанные сроки из смешанных культур готовят ряд последовательных десятикратных разведений. Из разведений 10^-5 и 10^-6 делают высевы по 0,1 см³ на чашки Петри со средой Эндо и выдерживают при температуре (37 ± 1) ⁰С в течение 18 часов, после чего на каждой чашке подсчитывают число колоний Е. coli (крупные красные колонии с металлическим блеском) и дизентерийные бактерии штаммов Флекснера и Зонне (мелкие прозрачные колонии).

Антагонистический показатель вычисляют по формуле:

К

А = ------------ х 100, где

К + Ф

К – число колоний кишечной палочки (Е. coli M-17),

Ф – число колоний тест-микроба.

Если при первичной проверке показатель антагонистической активности окажется ниже требуемого, контроль повторяют, используя удвоенное количество образцов.

СОДЕРЖАНИЕ