Киров 2005. Студентов 4 курса обучения

По учебной практике

Студентов 4 курса обучения

по специальности 012400 «Микробиология»

специализация 012405 «Биотехнология»

Экспериментальное производство колибактерина

Приготовление питательных сред

Киров 2005

Составители:

к.б.н., Лауреат Государственной премии РФ Г.В. Комоско;

д.т.н. А.А. Лещенко

В подготовке материалов принимали участие:

н.с. Г.В. Филимонова;

м.н.с. О.А. Чигринова

Рецензенты:

к.м.н., с.н.с., Лауреат премии Правительства РФ А.Н. Шевцов, начальник научного отдела НИИ микробиологии МО РФ;

к.т.н., с.н.с. С.С. Анкер, руководитель лаборатории госконтроля качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Краткие сведения о колибактерине

Колибактерин сухой представляет собой микробную массу живых колибацилл, лиофилизированных с добавлением одной из защитных сред: сахарозо-желатиновой или сахарозо-крахмальной.

Выпускается в сухом виде в ампулах или флаконах.

Препарат в ампулах или флаконах – кристаллическая или пористая масса желтовато-бежевого цвета.

Лечебный эффект препарата обусловлен антагонистическим действием микробных клеток колибацилл по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Колибактерин сухой предназначен для лечения детей и взрослых, страдающих хроническими колитами различной этиологии, в том числе неспецифическими язвенными колитами, осложненными дисбактериозами, возникшими в результате применения антибиотиков, сульфаниламидных препаратов и других причин.

Специальным сырьем для приготовления колибактерина сухого является маточная культура производственного штамма E. coli М-17 и питательные среды.

Производственный штамм E. coli М-17 принадлежит к виду Escherichia coli семейства Enterobacteriaceae (Кауфман, 1959). Штамм представляет собой подвижные грамотрицательные короткие палочки с закругленными концами. Штамм E. coli М-17 является аэробом, хорошо растет на простых питательных средах. На мясо-пептонном агаре через 12…18 часов штамм образует круглые, с ровными краями, мутноватые, выпуклые колонии. При выращивании штамма в мясо-пептонном бульоне происходит равномерное помутнение среды через 2…4 часа. На среде Эндо штамм образует розовые колонии с металлическим блеском. Штамм расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, манит, мальтозу, сахарозу. Желатина не разжижает. Оптимальная температура для роста микроба – 36…37 ⁰С. Штамм E. coli М-17 обладает антагонистической активностью в отношении шигелл и ряда других патогенных и условнопатогенных микроорганизмов кишечной группы. Антагонистическую активность производственного штамма E. coli М-17 оценивают в смешанных культурах по отношению к двум штаммам шигелл Флекснера и одному-двум штаммам шигелл Зоне. Антагонистический показатель по отношению к тест-штаммам шигелл Флекснера должен быть не ниже 60, а по отношению к тест-штаммам шигелл Зоне – не ниже 3.

Структурно процесс приготовления колибактерина сухого включает семь последовательных технологических стадий, представленных на рисунке. Этап приготовления питательных сред выполняется на стадии 2 перед получением нативной микробной взвеси.

Схема

процесса производства колибактерина

Рисунок

Питательные среды. Термины и определения

Питательные среды – искусственные субстраты, представляющие собой сбалансированную смесь питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, создающих наилучшие условия для роста микроорганизмов.

Питательные среды применяют при выращивании микроорганизмов и выделении их в чистой культуре, при получении биотехнологическими методами различных микробных препаратов (антибиотиков, вакцин, аминокислот, биостимуляторов, витаминов и т.д.) и изучении свойств микробов. Состав питательных сред и условия культивирования микроорганизмов в значительной степени определяют результаты микробиологических исследований.

Для построения белков клетки требуется азот, углерод, водород, кислород. Снабжение водородом и кислородом осуществляется за счет воды. Источники углерода многочисленны и многообразны. На первом месте стоят сахара, многоатомные спирты и кислоты. Углерод является также составной частью всех органических соединений, в том числе белков, пептонов, аминокислот. Поэтому в составе питательных сред специальные дополнительные источники углерода не нужны.

Основное внимание следует уделять источникам азота. Все искусственные питательные среды как самостоятельно изготавливаемые в лабораториях, так и выпускаемые централизованно (сухие питательные среды), имеют в своей основе вещества, содержащие азот. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного происхождения - мясо (преимущественно говяжье), рыба, мясо-костная мука, казеин. В ряде случаев используются заменители полноценного мяса - отходы мясо-молочной промышленности, плаценту, кровяные сгустки, а также дрожжи и белки растительного происхождения (соевые бобы, горох, ячмень и др.).

Микробам для нормального роста и развития нужны микроэлементы - небольшие количества некоторых металлов (железо, медь, марганец и др.). Микроэлементы участвуют в образовании коферментов, посредством которых сложные вещества подвергаются гидролизу до более простых и растворимых в воде соединений, ассимилируемых микробами. Неорганические вещества - соли, содержащие хлор, фосфор, натрий, калий, кальций, магний и некоторые другие

Синтетическим питательными средами называются такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. В качестве источника азота обычно используют различные аминокислоты или аммонийные соли.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, жидкими и полужидкими. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой основе 1,5-3% агара, полужидкие 0,3-0,4% агара, который представляет собой сложный полисахарид - продукт переработки особого вида морских водорослей, и в застывшем состоянии придает среде плотность. Агар плавится при температуре 80-88°С и затвердевает при температуре около 40°С. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10-15%). Такие естественные среды, как свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок, сами по себе являются плотными.

По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективные и дифференциально-диагностические. К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды, о которых уже говорилось выше. К питательным основам, наиболее используемым в микробиологии, относят триптические гидролизаты казеина, мяса, рыбных продуктов и др., из которых готовят жидкую среду - питательный бульон и плотную - питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления более сложных: сахарных, кровяных, сывороточных и др., удовлетворяющих пищевые потребности более требовательных патогенных бактерий.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида в местах их естественного обитания из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. Создавая элективные (для определенных микробов) питательные среды, исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококка наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона - в щелочной среде.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что равные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. Компонентами дифференциально-диагностических сред являются: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат (например, лактоза в среде Эндо), различное отношение к которому является диагностическим признаком для микроорганизмов; в) цветной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Дифференциально-диагностические среды широко используются в диагностических исследованиях для идентификации бактерий.

Правила приготовления питательных сред

При приготовлении питательных сред необходимо соблюдать следующие требования.

1. Использовать посуду из нержавеющего материала или с эмалевым покрытием, а также нейтрального стекла. Даже незначительное отклонение от правильного режима стерилизации отражается на качестве питательных сред и может привести к браку вследствие нестерильности или, наоборот, перегрева.

2. Строго соблюдать порядок внесения компонентов среды в соответствии с инструкцией или методикой.

3. Нельзя оставлять нагретую среду при высокой температуре длительное время из-за возможного разрушения компонентов под воздействием теплоты. После приготовления питательную среду немедленно разливают в соответствующую посуду и стерилизуют. Нежелательно стерилизовать среду повторно.

4. При приготовлении плотной питательной среды корректирование величины рН и фильтрование среды лучше проводить до добавления агара, внесение агара незначительно меняет реакцию среды, но контроль и корректировка величины рН также необходимы. Чтобы предотвратить изменение состава среды при корректировании величины рН, количество растворов, использованных при корректировании, должно быть минимальным. Не допускается перещелачивание или подкисление среды. В кислой среде ухудшаются условия для получения различных биологически активных веществ; нейтрализация щелочью избыточно внесенной кислоты может привести к образованию осадка в готовой питательной среде.

5. При нагревании (кипячении или стерилизации) значение величины рН среды может понизиться на 0,2, а иногда и на 0,3…0,4 ед.рН (при изготовлении сред с настоем печени, витаминами группы В, экстрактом отрубей). Это необходимо учитывать при установлении рН до стерилизации. После стерилизации в автоклаве рН проверяют вновь, для чего предусматривают дополнительный флакон со средой, который можно вскрыть после стерилизации.

6. Растворы углеводов рекомендуется готовить и стерилизовать отдельно, и вносить стерильно в среды перед посевом, т.к. при высоком значении рН (около 8,0 ед. рН) и нагревании, внесение углеводов может привести к карамелизации (образование коричневых веществ меланоидинов) среды, нежелательной при культивировании, или снижению значения рН до 5,0…6,0 ед.рН.

7. Следует учитывать изменение прозрачности гидролизатов, экстрактов и т. п. при стерилизации и при разных значениях рН, чтобы можно было определить причину выпадения осадков.

8. Агар лучше вносить в процессе изготовления среды при нейтральном рН. Кислая питательная среда при внесении в нее агара может не застыть или плохо застыть после автоклавирования. В таких случаях агар и другие составные части среды стерилизуют раздельно и затем смешивают, соблюдая стерильность.

9. При необходимости иногда рекомендуется в процессе приготовления питательной среды добавлять несколько больше воды, чем по прописи (с учетом выкипания).

2. СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНОГО ЗАНЯТИЯ

Цели занятия

1. Изучить прописи питательных сред и дополнительных растворов, используемых при производстве колибактерина.

2. Изучить состав сред высушивания, применяемых при лиофилизации колибактерина.

3. Познакомиться с порядком приготовления питательных сред, дополнительных растворов, сред высушивания в экспериментальном производстве.

4. Освоить технологии приготовления питательных сред, дополнительных растворов, сред высушивания, экспериментального производства колибактерина.

Сырье, материалы, реактивы и оборудование

К работам по приготовлению сред и дополнительных растворов для культивирования:

Сырье:

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709

Мясо – говядина и телятина, ГОСТ 779

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей, ГОСТ 13805

Натрий хлористый хч, чда, ГОСТ 4233

Агар микробиологический высш. сорт, ГОСТ 17206

Натр едкий технический, ТУ 6-01-1306

Дрожжи хлебопекарные прессованные, ТУ 9182-005-00353595

Казеин технический, ГОСТ 17026

Железы поджелудочные крупного рогатого скота (КРС), ГОСТ 11285

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4172

Натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный х.ч., ч.д.а., ГОСТ 11773

Масло подсолнечное нерафинированное, ТУ 9140-208-00334534 или аналогичное

Д-Глюкоза ч., ГОСТ 6038

Хлороформ технический, ГОСТ 20015 или хлороформ медицинский, ГФ изд. X-68, ст. 601

Реактивы:

Натрия гидроокись х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4328

Формалин технический, ГОСТ 1625 или формалин медицинский, ГФ изд. X-68, ст. 619

Фенолфталеин (индикатор), ч, ТУ 6-09-5360

Нейтральный красный (индикатор) ч.д.а., ТУ 6-09-4120

Кислота щавелевая, стандарт-титр, 0,1 Н раствор, ТУ 6-09-2540

Калий хлористый х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4234

Стандарт-титры для приготовления образцовых буферных растворов для рН-метрии 2-го разряда, ГОСТ 8.135

Посуда:

Пробирки исп. П1 и П2, ГОСТ 25336

Чашки биологические (Петри), ГОСТ 25336

Матрацы стеклянные вместимостью 1,5 дм³, ТУ 64-2-181

Флаконы вместимостью 100 см³, ТУ 64-2-100

Воронки стеклянные, ГОСТ 25336

Колбы мерные лабораторные, стеклянные, вместимостью 1000 см³, ГОСТ 1770

Стаканы стеклянные лабораторные с «носиком», тип В1, вместимостью 50, 100, 200, 400, 600, 1000 см³, ГОСТ 25336

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250, 500, 1000 см³, ГОСТ 1770

Палочки стеклянные лабораторного изготовления

Бюретка стеклянная без крана, вместимостью 25 см³, ГОСТ 20292-74Е или СТ СЭВ 1247

Пипетки мерные лабораторные вместимостью 1, 5, 10 см³, тип 1 и 2. ГОСТ 20292

Бутыли вместимостью 1, 5, 10, 15 дм³

Колбы конические лабораторные стеклянные вместимостью 100 см³, ГОСТ 25336

Материалы:

Вата медицинская гигроскопичная, ГОСТ 5556

Марля медицинская, ГОСТ 9412

Бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026

Пробки ватно-марлевые лабораторного изготовления

Нож кухонный

Кастрюли из нержавеющей стали или эмалированные вместимостью 3, 5, 10 дм³

Термометры ртутные стеклянные лабораторные с пределами измерений 0…100 ⁰С, ГОСТ 215

Оборудование:

Мясорубка бытовая

Иономер универсальный или рН-метр тип И-75, И-130, рН-673, рН-150, рН-150М, ТУ 25-05-2147

Весы лабораторные электронные, модель ВЛЭ 134-М, ТУ 25-7713.0031 или аналогичные

Электроплитка бытовая, тип ПЭК 800/3, ГОСТ 14919

Термостат электрический суховоздушный, ТУ 9452-02-00141798 или аналогичный

Баня водяная, ТУ 46-22-608

Автоклав, ГОСТ 14106

К работам по приготовлению сред высушивания:

Сырье:

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709

Сахароза х.ч., ч.д.а., ГОСТ 5833

Натрий углекислый кислый, ГОСТ 4201, хч или натрий двууглекислый (сода пищевая), ГОСТ 2156

Крахмал картофельный, ГОСТ 7699

Желатин пищевой, 1 сорт, ГОСТ 11293

Натр едкий технический, ТУ 6-01-1306 или натрия гидроокись х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4328

Реактивы:

Стандарт-титры для приготовления образцовых буферных растворов для рН-метрии 2-го разряда, ГОСТ 8.135

Калий хлористый х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4234

Посуда:

Стаканы стеклянные лабораторные с «носиком», тип В1, вместимостью 50, 100, 200, 400, 600, 1000 см³, ГОСТ 25336

Палочки стеклянные лабораторного изготовления

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250, 500, 1000 см³, ГОСТ 1770

Пробирки исп. П1 и П2, ГОСТ 25336

Флаконы вместимостью 100 см³, ТУ 64-2-100

Флаконы вместимостью 400 см³

Материалы:

Вата медицинская гигроскопичная, ГОСТ 5556

Марля медицинская, ГОСТ 9412

Бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026

Пробки ватно-марлевые лабораторного изготовления

Оборудование:

Весы лабораторные электронные, модель ВЛЭ 134-М, ТУ 25-7713.0031 или аналогичные

Электроплитка бытовая, тип ПЭК 800/3, ГОСТ 14919

Иономер универсальный или рН-метр тип И-75, И-130, рН-673, рН-150, рН-150М, ТУ 25-05-2147

Автоклав, ГОСТ 14106

К работам по контролю качества питательных основ, сред и дополнительных растворов:

Реактивы:

Натрия гидроокись х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4328

Формалин технический, ГОСТ 1625 или формалин медицинский, ГФ изд. X-68, ст. 619

Фенолфталеин (индикатор), ч., ТУ 6-09-5360

Нейтральный красный (индикатор) чда, ТУ 6-09-4120

Кислота щавелевая, стандарт-титр, 0,1 Н раствор, ТУ 6-09-2540

Калий хлористый х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4234

Стандарт-титры для приготовления образцовых буферных растворов для рН-метрии 2-го разряда, ГОСТ 8.135

Натрия гидроокись х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4328

Медь сернокислая 5-водная х.ч., ч.д.а., ГОСТ 4165

Метиловый красный ч.д.а., ТУ 6-09-5169-84

Кислота серная х.ч., ГОСТ 4204

Спирт этиловый ректификованный, ГОСТ 5962

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709

Посуда:

Воронки стеклянные, ГОСТ 25336

Колбы мерные лабораторные, стеклянные, вместимостью 1000 см³, ГОСТ 1770

Стаканы стеклянные лабораторные с «носиком», тип В1, вместимостью 50, 100, 200, 400, 600, 1000 см³, ГОСТ 25336

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250, 500, 1000 см³, ГОСТ 1770

Бюретка стеклянная без крана, вместимостью 25 см³, ГОСТ 20292-74Е или СТ СЭВ 1247

Пипетки мерные лабораторные вместимостью 1, 5, 10 см³, тип 1 и 2. ГОСТ 20292

Бутыли вместимостью 1, 5, 10, 15 дм³

Колбы конические лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250 см³, ГОСТ 25336

Колбы Кьельдаля вместимостью 100 см³, ГОСТ 10394

Колбы конические лабораторные стеклянные вместимостью 250 см³, ГОСТ 25336

Втулки стеклянные полые для колб Къельдаля

Холодильник стеклянный лабораторный, ГОСТ 3499

Материалы:

Бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026

Термометры ртутные стеклянные лабораторные с пределами измерений 0…100 ⁰С, ГОСТ 215

Оборудование:

Иономер универсальный или рН-метр тип И-75, И-130, рН-673, рН-150, рН-150М, ТУ 25-05-2147

Весы лабораторные электронные, модель ВЛЭ 134-М, ТУ 25-7713.0031 или аналогичные

Электроплитка бытовая, тип ПЭК 800/3, ГОСТ 14919

Нагреватель для колб тип НК, ТУ 79-483-82

Ход работы

I Приготовление питательных сред и дополнительных растворов для культивирования

Работа 1. Приготовление мясо-пептонного бульона

Первым этапом приготовления мясо-пептонного бульона является приготовление мясной воды.

Мясо крупного рогатого скота освободить от костей, жира и сухожилий, приготовить фарш. Навеску фарша массой 500 г залить 1 дм³ дистиллированной воды, перемешать и поставить настаиваться в течение суток в прохладном месте. Замерить объем смеси. Затем настой вместе с мясом при помешивании прокипятить в течение 1 часа. Вновь замерить объем и подвести его до первоначального дистиллированной водой. После этого перемешать и профильтровать через бумажный фильтр, помещенный на стеклянную воронку. Разлить в соответствующую стеклянную тару. Посуду с бульоном закрыть ватно-марлевыми пробками и простерилизовать в автоклаве при температуре (120 ± 2) ⁰С в течение 30 минут.

К 500 см³ мясной воды добавить 500 см³ дистиллированной воды, 10 г сухого пептона и 5 г натрия хлористого. Смесь подогреть на электрической плитке при помешивании до растворения компонентов. Откорректировать величину рН среды до значений рН 7,2…7,6 ед.рН, используя 20 %-ный раствор гидроокиси натрия. Среду прокипятить 5…10 минут, профильтровать через бумажный фильтр, помещенный на стеклянную воронку, разлить в стеклянную тару, закрыть ватно-марлевыми пробками и простерилизовать в автоклаве при температуре (120 ± 2) ⁰С в течение 30 минут.

Работа 2. Приготовление мясо-пептонного агара

К 1,0 дм³ мясо-пептонного бульона добавить 15…20 г агара. Агар расплавить в автоклаве путем обработки текучим паром, или нагреванием на водяной бане, постоянно помешивая. После расплавления агара установить величину рН среды в значениях 7,2…7,6 ед.рН, используя 20 %-ный раствор едкого натра. Профильтровать через марлевый фильтр (три слоя медицинской марли), помещенный на стеклянную воронку, разлить в стеклянную тару (флаконы вместимостью 400 см³, пробирки) и простерилизовать в автоклаве при температуре (120 ± 2) ⁰С в течение 30 минут. Среду в пробирках скосить. Для этого пробирки с расплавленной горячей средой установить в наклонном положении, используя деревянный брусок или валик из полотенца (ткани), так, чтобы столбик среды внизу пробирки был не менее 1 см, а верхний конец «косяка» заканчивался за 3…4 см до ватно-марлевой пробки. Пробирки в таком положении оставить до полного застывания среды.

Работа 3. Приготовление дрожжевого агара

Для приготовления дрожжевого агара предварительно готовят дрожжевой автолизат.

Приготовление дрожжевого автолизата

Навеску прессованных хлебопекарных дрожжей массой 2 кг измельчить (нарезать кусочками), поместить в стеклянную бутыль вместимостью 10 дм³. Открытую бутыль с дрожжами (без добавления воды) поставить в термостат и выдержать при температуре53…56 ⁰С в течение 2…3 суток, перемешивая 5…6 раз в сутки. Затем в бутыль с жидкостью, которая образовалась при автолизе, добавить 3 дм³ подогретой до температуры (45 ± 2) ⁰С водопроводной воды. Содержимое бутыли перемешать и простерилизовать в автоклаве при температуре (120 ± 2) ⁰С в течение 30 минут.

Для приготовления дрожжевого агара отобрать 1 дм³ надосадочной жидкости стерильного дрожжевого автолизата, откорректировать величину рН до значений (7,4 ± 0,1) ед.рН 20 %-ным раствором едкого натра. Далее добавить 30 г агара, смесь расплавить в автоклаве текучим паром или при нагревании на водяной бане, постоянно помешивая. После расплавления агара повторно проконтролировать величину рН среды и при необходимости откорректировать величину рН до значения (7,4 ± 0,1) ед.рН, используя 20 %-ный раствор едкого натра. Среду разлить в матрацы по 300 см³, простерилизовать в автоклаве при температуре (120 ± 2) ⁰С в течение 30 минут и скосить. С этой целью матрацы с расплавленной горячей средой установить в наклонном положении, используя деревянный брусок или валик из полотенца (ткани), так, чтобы столбик среды внизу матраца был не менее 1 см, а верхний конец «косяка» заканчивался за 3…4 см до ватно-марлевой пробки. Матрацы в таком положении оставить до полного застывания среды.

Работа 4. Приготовление казеинового гидролизата

Приготовление казеинового гидролизата (вариант 1)

В реактор залить (10.0 ± 0,5) дм³ водопроводной воды. Взвесить 600 г казеина и при работающей мешалке загрузить в реактор. Гидролизуемую смесь нагреть до температуры (80 ± 1) ⁰С. Нагрев смеси производить подачей пара в рубашку реактора при работающей мешалке.

При достижении заданной температуры подачу пара прекратить. Величину рН смеси, используя 20%-ный раствор едкого натра, откорректировть до значения 8,0…8,5 ед.рН. Выдержать гидролизуемую смесь при температуре (80 ± 1) ⁰С в течение 2 ч, при постоянном перемешивании и подщелачивании 20%-ным раствором едкого натра до установления стабильного значения величины рН смеси 7,8…8,0 ед.рН.

После выдержки гидролизуемую смесь охладить до температуры (45 ± 2) ⁰С, подавая в рубашку реактора холодную воду.

Подготовить навеску фарша поджелудочной железы крупного рогатого скота. Для этого поджелудочную железу измельчить на мясорубке. Навеску фарша поджелудочной железы массой 300 г внести в реактор при работающей мешалке.

Процесс гидролиза вести 4 ч при температуре (45 ± 2) ⁰С при постоянном перемешивании.

Величину рН корректировать до значения 7,7…7,8 ед.рН в течение всего процесса гидролиза 20 %-ным раствором едкого натра.

После окончания гидролиза величину рН довести концентрированной соляной кислотой до значения 4,4…4,5 ед.рН.

Полученную смесь нагреть до температуры (100 ± 2) ⁰С. Нагрев производить подачей пара в рубашку реактора. При достижении заданной температуры смесь выдержать в течение 10…15 мин. Затем путем последовательной подачи в рубашку реактора горячей и холодной воды гидролизат охладить до температуры (80 ± 5) ⁰С. Нагрев, выдержку и охлаждение смеси проводить при постоянном перемешивании.

После охлаждения гидролизат профильтровать через бельтинг или фильтровальную бумагу, помещенные на воронку.

Фильтрованный гидролизат собрать в стеклянную тару (бутыли), добавить хлороформ 10 см³/дм³. Бутыли с гидролизатом закрыть плотно пробками и убрать в холодильную камеру с температурой 2…8 ⁰С.

В пробе фильтрованного гидролизата казеина определить концентрацию аминного азота, которая должна быть не менее 250 мг%. Определение содержания аминного азота провести согласно работе № 13 данных методических указаний (с.19).

Приготовление казеинового гидролизата (вариант 2)

В промежуточную емкость (эмалированное ведро) залить 10 дм³ водопроводной воды. Воду нагреть на электрической плитке до температуры (45 ± 2) ⁰С. Контроль температуры произвести лабораторным термометром. Навеску казеина массой 600 г загрузить в промежуточную емкость с подогретой водой, смесь перемешать и выдержать при температуре (45 ± 2)⁰С 20…30 минут. Температуру смеси поддерживать подогревом на электрической плитке. Затем 20 %-ным раствором едкого натра откорректировать величину рН смеси до значений 8,0…8,5 ед.рН. Смесь выдержать при температуре (45 ± 2)⁰С в течение 2 часов при периодическом перемешивании и дополнительном подщелачивании до установления стабильного значения рН смеси 7,8…8,0 ед.рН. Подготовить фарш поджелудочной железы КРС. Для этого поджелудочную железу измельчить на мясорубке. Навеску фарша железы массой 200 г добавить в промежуточную емкость к раствору казеина. Смесь перемешать, залить в реактор, установить и закрепить крышку реактора, включить мешалку на 1…2 минуты. Температуру гидролизуемой смеси в реакторе поддерживать подачей воды с температурой (45 ± 2)⁰С в рубашку реактора. Для подогрева воды использовать термостат. Через 1 час после введения ферментного препарата (фарш поджелудочной железы) в гидролизуемой смеси откорректировать величину рН до значений 7,7…7,8 ед.рН раствором едкого натра. Отбор проб из реактора производить при помощи сжатого воздуха. Введение раствора щелочи в гидролизуемую смесь при корректировке величины рН производить при помощи вакуума. Через 2 часа после введения ферментного препарата в реактор при помощи вакуума добавить хлороформ (консервант) из расчета 10 см³ на 1 см³ смеси.

Гидролиз вести при температуре (45 ± 2) ⁰С в термостате 3…4 суток с периодическим перемешиванием (в течение первых двух часов гидролиза через 10…15 минут, далее – 5…6 раз в сутки). В процессе гидролиза величину рН смеси поддерживать на уровне значений 7,7…7,8 ед.рН, при необходимости добавляя 20 %-ный раствор едкого натра.

Один раз в сутки отбирать пробы для определения содержания аминного азота. Определение содержания аминного азота провести согласно работы № 13 данных методических указаний (с.19). После прекращения нарастания величины аминного азота процесс гидролиза считается завершенным. Гидролизат при помощи сжатого воздуха подать в промежуточную емкость, затем профильтровать через бельтинг или фильтровальную бумагу, помещенные на воронку. Фильтрованный гидролизат разлить в стеклянную тару, добавить хлороформ 10 см³/дм³. Бутыли с гидролизатом закрыть плотно пробками и убрать в холодильную камеру с температурой 2…8 ⁰С.

В пробе фильтрованного гидролизата казеина определить концентрацию аминного азота, которая должна быть не менее 250 мг%.

Работа 5. Приготовление казеинового бульона

Для приготовления казеинового бульона предварительно необходимо обработать желатин для получения желатозы.

Обработка желатина для получения желатозы

Желатин залить дистиллированной водой из расчета: на 125…200 г желатина – 1 дм³ воды, и оставить набухать на 2…3 часа. Затем смесь перемешать и нагреть на водяной бане при постоянном помешивании до расплавления желатина. Профильтровать через марлевый фильтр (2 слоя медицинской марли). Разлить в стеклянную тару и простерилизовать в автоклаве при температуре (130 ± 2) ⁰С в течение 2 часов. При добавлении в бульон желатозу расплавить.

Приготовление 10 %-ного раствора крахмала

Навеску крахмала массой 50 г залить 450 см³ дистиллированной воды. Смесь перемешать и нагреть при постоянном помешивании до кипения. Раствор приготовить непосредственно перед приготовлением казеинового бульона.

Приготовление казеинового бульона

Для приготовления казеинового бульона в варочную емкость налить расчетное количество гидролизата казеина и дистиллированной воды. Расчет необходимого количества ингредиентов среды произвести (определить) исходя из содержания аминного азота в гидролизате казеина и требуемого объема бульона. Полученную смесь перемешать и отобрать пробу объемом 50…60 см³ для контроля величины аминного азота, которая должна составлять 220…270 мг%. Для определения величины аминного азота пробу нагреть на электрической плитке до кипения, охладить и затем приступить к определению. Определение содержания аминного азота провести согласно работе № 13 данных методических указаний (с.19).

При несоответствии величины аминного азота заданным параметрам к смеси по расчету добавить гидролизат или дистиллированную воду. В смесь внести соли из расчета на 1 дм³ среды: натрий хлористый 3 г и натрий фосфорнокислый двузамещенный водный – 1 г (при использовании натрия фосфорнокислого двузамещенного безводного навеска соли составит 0,4 г).

Содержимое варочной емкости нагреть при помешивании до кипения. Откорректировать величину рН смеси до значения 7,8…7,9 ед.рН 20 %-ным раствором едкого натра. После корректировки величины рН смесь прокипятить 5…7 минут.

Бульон профильтровать через бумажный фильтр, помещенный на воронку. К фильтрованной среде добавить расплавленную желатозу и 10 %-ный раствор крахмала в количестве 110 см³ каждого раствора на 1 дм³ бульона (конечная концентрация желатозы в бульоне – 1,25…2,00 %, крахмала – 1 %). Бульон перемешать и разлить в стеклянную тару, снабдить монтажом), и простерилизовать в автоклаве при температуре (120 ± 2) ⁰С в течение 30 минут. В данном случае монтаж – оснащение посуды со средой резиновой пробкой с канюлями (специальными стеклянными или металлическими трубками), согласно регламента производства с. 38, монтаж № 3, рис. 1.

1 - бутыль;

2 - стеклянная длинная канюля;

3 - стерильное уплотнение;

4 - переход с ватной набивкой;

5 - стеклянный фильтр с ватной набивкой;

6 - вакуумная резиновая трубка;

7 - короткая канюля;

8 - ватное уплотнение;

9 - герметичное уплотнение.

Рисунок 1 - Одно-, пяти- или двадцатилитровая бутыль для отбора осадка

Работа 6. Подготовка масла растительного

Растительное масло (подсолнечное) разлить в стеклянную тару и простерилизовать в автоклаве при температуре (100 ± 2) ⁰С в течение 1 часа. Стерилизацию повторить два раза через 12…20 часов.

Работа 7. Приготовление раствора глюкозы

К навеске глюкозы массой 400 г добавить 600 см³ дистиллированной воды. Смесь при постоянном помешивании нагреть на электрической плитке до растворения глюкозы. Объем полученного раствора довести дистиллированной водой до 1 дм³. Раствор профильтровать через марлевый фильтр, разлить в стеклянную тару, снабдить монтажом (см. работу 5 данных методических указаний) и простерилизовать в автоклаве при температуре (100 ± 2) ⁰С в течение 1 часа. Стерилизацию повторяют 2 раза через 12…20 часов.

II Приготовление сред высушивания

Работа 8. Приготовление раствора сахарозы

Навеску сахарозы массой 600 г залить 400 см³ дистиллированной воды. Смесь нагреть при постоянном помешивании до полного растворения сахарозы. Объем полученного раствора довести до 1 дм³ дистиллированной водой. Раствор перемешать и откорректировать величину рН до значения рН 7,7…7,8 ед.рН, используя 10 %-ный раствор бикарбоната натрия.

Готовый полученный раствор сахарозы профильтровать через марлевый фильтр (медицинская марля в 3…5 слоев), помещенный на воронку, разлить в стеклянную тару, закрыть ватно-марлевой пробкой и простерилизовать в автоклаве при температуре (110 ± 2) ⁰С в течение 30 минут.

Работа 9. Приготовление крахмальной среды

Крахмал в количестве 4 г залить 96 см³дистиллированной воды, смесь при постоянном помешивании нагреть до кипения. Полученный раствор профильтровать через марлевый фильтр, разлить в стеклянную тару, закрыть ватно-марлевой пробкой и простерилизовать в автоклаве при температуре (100 ± 2) ⁰С в течение 1 часа. Стерилизацию повторяют 2 раза через 12…20 часов.

Работа 10. Приготовление сахарозо-желатиновой среды

В 1 дм³ дистиллированной воды откорректировать величину рН до значения 7,0…7,1 ед.рН 20 %-ным раствором гидроокиси натрия.

Навеску желатина массой 10 г залить 500 см³ дистиллированной воды с рН 7,0…7,1 ед.рН и оставить для набухания на 1…2 часа. Затем смесь нагреть при постоянном помешивании до кипения на водяной бане.

Навеску сахарозы массой 100 г залить 400 см³ дистиллированной воды с рН 7,0…7,1 ед.рН. Раствор подогреть на электрической плитке при помешивании до растворения сахарозы.

Полученные растворы желатина и сахарозы объединить и довести объем среды до 1 дм³, используя дистиллированную воду с рН 7,0..7,1 ед.рН. Полученный раствор перемешать и откорректировать величину рН до значения 7,0…7,1 ед.рН, используя 20 %-ный раствор гидроокиси натрия. Готовую среду профильтровать через марлевый фильтр, разлить в стеклянную тару, закрыть ватно-марлевой пробкой и простерилизовать в автоклаве при температуре (110 ± 2) ⁰С в течение 30 минут.

Работа 11. Приготовление сахарозо-крахмальной среды

Навеску сахарозы массой 100 г растворить в 500 см³ дистиллированной воды при нагревании и помешивании.

Крахмал в количестве 20 г залить 300 см³ дистиллированной воды. При постоянном помешивании раствор нагреть до кипения.

Полученные растворы сахарозы и крахмала объединить, перемешать и довести объем смеси до 1 дм³ дистиллированной водой. В полученной среде откорректировать величину рН 10 %-ным раствором бикарбоната натрия до значения рН 7,1…7,2 ед.рН. Среду профильтровать через марлевый фильтр, разлить в стеклянную тару, закрыть ватно-марлевой пробкой и простерилизовать в автоклаве при температуре (110 ± 2) ⁰С в течение 30 минут.

III Контроль качества питательных основ, сред и дополнительных растворов

Работа 12. Определение показателя концентрации водородных ионов

Приготовить насыщенный водный раствор калия хлористого: 350 г калия хлористого растворить при нагревании в 1 дм³ дистиллированной воды.

Приготовить стандартные буферные растворы согласно инструкции по пользованию стандарт-титрами для рН-метрии.

Перед началом работы провести проверку рН-метра по стандартным буферным растворам при температуре 20…25 ⁰С. Различие между показателями прибора и номинальным значением рН стандартного буферного раствора не должно превышать 0,04 ед.рН.

Проведение анализа

Исследуемую пробу в количестве 20…40 см³ налить в химический стакан вместимостью 50 см³. Электроды рН-метра аккуратно погрузить в стакан с анализируемой пробой так, чтобы стенки стакана и электродов не соприкасались. Отсчет величины рН по шкале прибора произвести после того, как показания примут установившееся значение.

Перед каждым погружением электродов в исследуемую пробу, их необходимо промыть дистиллированной водой, а затем удалить остатки воды фильтровальной бумагой.

Обработка результатов

Результаты выражают в единицах рН. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,05 единицы рН. За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Определение величины рН проводят при температуре исследуемой пробы: 22…25 ⁰С. В средах, содержащих агар и желатин, величину рН определяют при температуре среды: 36…40 ⁰С. В этом случае необходимо сделать соответствующие поправки на температуру.

При контроле качества гидролизатов одним из важных показателей также является содержание общего азота. Данные о количестве аминного и общего азота в ПО позволяют характеризовать процесс гидролиза.

Работа 13. Определение аминного азота методом формольного титрования

Подготовка к анализу

Приготовить следующие рабочие растворы:

1 %-ный раствор натрия гидроокиси: 1 г натрия гидроокиси растворить в 99 мл дистиллированной воды;

1 %-ный раствор соляной кислоты: к 2,3 см³ концентрированной соляной кислоты (плотность 1,18 г×см^-3) добавить 97,3 см³ дистиллированной воды;

1 %-ный раствор фенолфталеина в этиловом спирте: 1 г фенолфталеина растворить в 99 см³ этилового спирта;

0,1 %-ный раствор индикатора нейтрального красного: 0,1 г индикатора растворить в 50 см³ этилового спирта и довести дистиллированной водой до 100 см³;

раствор формольной смеси: к 50 см³ (35…40) %-ного раствора формалина добавить 2 см³ 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина и 1 %-ный раствор натрия гидроокиси до появления светло- розового окрашивания;

0,1 н раствор едкого натра: 4 г реактива растворить в дистиллированной воде, не содержащей углекислоты (предварительно прокипяченной), и довести объем до 1 дм³. Нормальность раствора установить по щавелевой кислоте.

С этой целью приготовить титрованный 0,1 н раствор щавелевой кислоты из стандарт-титра (фиксанала).

Для определения нормальности рабочего раствора натрия гидроокиси необходимо взять 3…5 колб вместимостью 100 см³, мерной пипеткой отобрать в них по 10 см³ титрованного раствора щавелевой кислоты, добавить 1…3 капли 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колб перемешать и оттитровать рабочим раствором натрия гидроокиси до появления розовой окраски титруемого раствора. Титрование повторить не менее трех раз. Результаты титрования не должны расходиться более, чем на 0,1 см³. В случае расхождения полученных результатов на большую величину титрование повторить. Для вычисления берут среднее арифметическое трех параллельных определений.

Обработка результатов

Расчет точной нормальности рабочего раствора натрия гидроокиси Nщ произвести по формуле:

Nк ^. Vк

Nщ = ----------

Vщ

где Nк – нормальность раствора щавелевой кислоты, 0,1 н;

Vк – количество раствора щавелевой кислоты, взятое на анализ, см³;

Vщ – количество рабочего раствора натрия гидроокиси, пошедшее на титрование, см³.

Проведение анализа

В стакан вместимостью 50 или 100 см³ мерной пипеткой отобрать 1 см³ исследуемой питательной основы (гидролизата) или 10 см³ питательной среды, добавить (20…25) см³ дистиллированной воды, (3…4) капли 0,1 %-ного раствора индикатора нейтрального красного. На иономере замерить рН раствора и при необходимости доводят значение до 7,0 разбавленными растворами кислоты или щелочи (1 %-ными). Затем в пробу добавить 5 см³ свежеприготовленного раствора формольной смеси, после чего пробу оттитровать 0,1 н раствором натрия гидроокиси. При титровании происходит изменение окраски раствора: розовая – желтая – малиновая. Конечную точку титрования определить по иономеру. Величина рН должна быть равной 9,0…9,2 ед.рН.

Обработка результатов

Расчет содержания аминного азота в мг % производят по формуле:

V ^. 1,4 ^. К ^. 100

Аминный азот = -----------------------,

В

где V – количество 0,1 н раствора натрия гидроокиси, израсходованное на титрование пробы, см³;

В – количество пробы, взятое на анализ, см³;

К – поправочный коэффициент к нормальности 0,1 н рабочего раствора натрия гидроокиси, расчет которого производят по формуле:

Фактическая нормальность приготовленного раствора натрия гидроокиси

К = -------------------------------------------------------------------------------------------;

Требуемая нормальность раствора натрия гидроокиси (0,1 н)

1,4 – количество аминного азота, соответствующее 1 см³ 0,1 н раствора натрия гидроокиси, мг;

100 – коэффициент пересчета в мг%.

Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 5 %. За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Работа 14. Определение общего азота методом сжигания пробы (по Къельдалю)

Подготовка к анализу

Приготовить следующие рабочие растворы:

0,1 н раствор серной кислоты: приготовить из фиксанала;

33 %-ный раствор натрия гидроокиси: 330 г натрия гидроокиси растворить в 670 мл дистиллированной воды;

0,1 %-ный раствор метилового красного в 60 %-ном этиловом спирте: 0,1 г индикатора растворить в 60 см³ спирта и довести дистиллированной водой до 100 см³;

0,1 н раствор натрия гидроокиси: 4 г гидроокиси натрия растворить в дистиллированной воде, не содержащей углекислоты (предварительно прокипяченной), и довести объем до 1 дм³. Нормальность раствора установить по раствору щавелевой кислоты.

С этой целью приготовить титрованный 0,1 н раствор щавелевой кислоты из стандарт-титра (фиксанала).

Для определения нормальности рабочего раствора натрия гидроокиси необходимо взять 3…5 колб вместимостью 100 см³, мерной пипеткой отобрать в них по 10 см³ титрованного раствора щавелевой кислоты, добавить 1…3 капли 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колб перемешать и оттитровать рабочим раствором натрия гидроокиси до появления розовой окраски титруемого раствора. Титрование повторить не менее трех раз. Результаты титрования не должны расходиться более, чем на 0,1 см³. В случае расхождения полученных результатов на большую величину титрование повторить. Для вычисления берут среднее арифметическое трех параллельных определений.

Обработка результатов

Расчет точной нормальности рабочего раствора натрия гидроокиси Nщ произвести по формуле:

Nк ^. Vк

Nщ = ----------

Vщ

где Nк – нормальность раствора щавелевой кислоты, 0,1 н;

Vк – количество раствора щавелевой кислоты, взятое на анализ, см³;

Vщ – количество рабочего раствора натрия гидроокиси, пошедшее на титрование, см³.

Проведение анализа

Метод основан на окислении органических веществ пробы при сжигании ее в серной кислоте в присутствии катализатора, отгоне образующегося аммиака и улавливании его титрованным раствором серной кислоты с последующим титрованием ее избытка. По количеству связанной аммиаком кислоты судят о массовой доле азота в исследуемой пробе.

Калиброванной пипеткой взять 1 см³ гидролизата или 5 см³ питательной среды и поместить в колбу Къельдаля вместимостью 100 см³. Пробу необходимо вносить в колбу так, чтобы пипетка не касалась горла колбы (конец пипетки прикасается к расширенной части колбы почти у дна), добавить 2…3 см³ дистиллированной воды, 5 см³ концентрированной серной кислоты, 70…100 мг (на кончике шпателя) меди сернокислой (катализатор), закрыть колбу стеклянной полой крышкой, осторожно перемешать содержимое (без встряхивания) и устанавить в колбонагреватель.

Содержимое колбы нагреть до кипения и кипятить в течение 2…6 ч до тех пор, пока раствор в колбе не станет прозрачным и примет зеленовато-голубой цвет (при охлаждении раствор обесцвечивается). Внутренние стенки колбы должны быть совершенно чистыми.

Сжигание вещества проводить в вытяжном шкафу.

После окончания озоления колбу Къельдаля охладить, затем горло колбы и внутреннюю поверхность стеклянной втулки обмыть небольшим количеством дистиллированной воды из промывалки. Содержимое колбы вновь перемешать и охладить.

Для отгонки аммиака собрать специальную установку (рисунок 2), которая состоит из парообразователя – большой плоскодонной колбы 1, колбы для сброса конденсата 2, колбы Къельдаля 3, капельной воронки для раствора натрия гидроокиси 4, холодильника 5, каплеуловителя 6, колбы-приемника 7, зажимов 8, 9 и 10.

В коническую колбу-приемник на 250 см³ мерно налить 20 см³ 0,1 н раствора серной кислоты и поставить под холодильник так, чтобы конец трубки холодильника был погружен в кислоту, для чего под дно колбы-приемника устанавить регулирующееся по высоте кольцо штатива.

Колбу Къельдаля соединить с парообразователем и через каплеуловитель с холодильником. К этому времени вода в колбе-парообразователе должна закипеть, зажим 9 открыть, зажим 8 перекрыть (поступление пара в колбу Къельдаля).

В колбу Къельдаля, используя зажим 10, осторожно прилить из капельной воронки 33 %-ный раствор натрия гидроокиси до тех пор, пока раствор в колбе не потемнеет. Конец стеклянной трубки, по которой поступает раствор натрия гидроокиси, должен находиться в растворе пробы. Содержимое колбы Къельдаля при добавлении раствора щелочи необходимо осторожно перемешивать.

Далее зажим 8 открыть, а зажим 9 – закрыть и начать отгонку аммиака паром. Процесс отгонки идет в течение 15…20 мин, объем раствора в приемной колбе при этом должен увеличиться до 70…80 см³ (примерно в три-четыре раза). Окончание процесса отгонки аммиака проверить по красной лакмусовой бумажке. Для этого кольцо штатива с приемной колбой опустить так, чтобы конец трубки холодильника был на 2…3 см выше раствора кислоты. Конец трубки холодильника обмыть под приемником небольшим количеством дистиллированной воды из промывалки, затем смочить красную лакмусовую бумажку каплей жидкости, стекающей из трубки холодильника. Если лакмусовая бумажка не изменит окраску, отгонку аммиака считают законченной, если посинеет – отгонку следует продолжить.

Во время отгонки (во избежание обратного втягивания жидкости из приемника) не допускается снижать нагревание!

По окончании отгонки аммиака коническую колбу-приемник опустить с таким расчетом, чтобы конец трубки холодильника не касался раствора, и дать некоторое время (1…2 мин) для свободного стекания жидкости. Зажим 9 открыть, зажим 8 закрыть. Колбу Къельдаля отсоединить от установки, а стеклянную трубку, которая была погружена в нее, обмыть дистиллированной водой из промывалки. Конец трубки холодильника, который опускался в кислоту над приемной колбой, обмыть небольшим количеством дистиллированной воды.

К содержимому приемной колбы добавить 2…4 капли индикатора метилового красного и оттитровать 0,1 н раствором натрия гидроокиси до перехода окраски от розового в слабо-желтый цвет.

При использовании вновь приготовленных реактивов провести контрольный опыт (холостая проба) в аналогичных условиях, где вместо исследуемой пробы взять дистиллированную воду. Результаты контрольного опыта использовать в расчетной формуле.

Обработка результата

Расчет количества общего азота в мг % производят по формуле:

Общий азот = ,

где V – объем 0,1 н раствора натрия гидроокиси, израсходованный на титрование раствора серной кислоты в контрольном опыте, см³;

V₁ – объем 0,1н раствора едкого натра, израсходованный на титрование избытка серной кислоты в рабочем опыте, см³;

1,4 – количество азота, соответствующее 1 см³ 0,1н раствора натрия гидроокиси, мг;

К – поправочный коэффициент к нормальности 0,1н рабочего раствора натрия гидроокиси, расчет которого провести согласно работе № 13 данных методических указаний (с. 21);

В – объем пробы, взятой на анализ, см³;

100 – коэффициент пересчета в мг%

Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 5 %. За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Установка для отгонки аммиака

Рисунок 2

3. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ

Согласно правилам техники безопасности каждый работающий в лаборатории обязан знать и беспрекословно выполнять следующие правила внутреннего распорядка, техники безопасности и противопожарной техники:

1. К работе в лаборатории допускаются лица, прошедшие инструктаж и обучение безопасным методам работы.

2. Не входить в лабораторию в уличной одежде и обуви.

3. Перед началом работы надеть соответствующую спецодежду (халат, медицинская шапочка или косынка, тапочки). Иметь на рабочем месте и в случае необходимости использовать индивидуальные средства защиты органов дыхания, глаз, рук (марлевые повязки, «лепестки», очки из органического стекла, резиновые перчатки, передники, сапоги).

4. В лаборатории запрещается принимать пищу, курить, перемещаться без надобности, делать порывистые движения.

5. Запрещается выполнение работ, не связанных с заданием и не предусмотренных рабочими инструкциями.

6. Перед началом работы необходимо убедиться в исправности оборудования, приборов, вентиляции.

7. Не держать на рабочем месте (столе) предметы, не используемые в работе (сумки, ненужные книги и пр.), не загромождать коридоры и проходы, а также подходы к средствам пожаротушения.

8. Емкости с реактивами, растворами и другими химическими веществами, имеющиеся в лаборатории, должны иметь этикетки с разборчивыми подписями с указанием наименования вещества и его основных характеристик.

9. При работе с едкими (агрессивными, вызывающими химические ожоги) веществами (кислоты, концентрированные растворы щелочей, перекись водорода и др.) необходимо использовать защитные очки (козырьки), перчатки, прорезиненные или полиэтиленовые фартуки, сапоги, а в отдельных случаях – противогазы соответствующей марки. Выполнение работ с едкими веществами без применения индивидуальных средств защиты запрещается.

10. Открывать сосуды с концентрированными кислотами, щелочами, летучими веществами и готовить растворы из них разрешается только в вытяжных шкафах с включенной принудительной вентиляцией.

11. При приготовлении растворов кислот необходимо приливать кислоту в воду тонкой струей при непрерывном перемешивании. Запрещается приливать воду в кислоту, во избежание ожогов от брызг.

12. Для приготовления растворов кислот и щелочей использовать посуду из термически и химически стойкого стекла.

13. Отбирать навески материалов и реактивов разрешается только с помощью шпателей или ложечек (фарфоровых или из нержавеющей стали).

14. При работах с использованием пипеток запрещается втягивать в них жидкости ртом, для этого применяют резиновые груши.

15. Мойку лабораторной посуды следует производить с применением средств индивидуальной защиты (перчатки, очки, фартук, резиновые сапоги).

16. При переносе сосудов с горячей жидкостью необходимо пользоваться полотенцем или другими материалами. Сосуд при этом следует держать обеими руками: одной рукой за дно, другой за горловину.

17. При работе с использованием электронагревательных приборов необходимо соблюдать правила противопожарной безопасности.

18. Работать на неисправном и на незаземленном электрооборудовании запрещается.

19. Нельзя оставлять без присмотра действующие (включенные) электронагревательные приборы. При необходимой отлучке, даже на непродолжительное время, источники нагрева должны быть отключены.

20. При замеченных неисправностях применяемого инструмента и оборудования или при возникновении аварийной обстановки необходимо: прекратить работы и предупредить об опасности работающих рядом людей; немедленно сообщить о сложившейся ситуации руководителю работ.

21. По окончании работы каждый работающий в лаборатории обязан проверить и привести в порядок свое рабочее место: все реактивы и материалы, которые использовались в работе, поставить на отведенные места; использованную в работе посуду вымыть; отключить нагревательные приборы; перекрыть краны, подающие воду.

4. ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

1. Питательная среда.

2. Правила приготовления питательных сред.

3. Основные питательные среды и их предназначение.

4. Элективные питательные среды и их предназначение.

5. Предназначение дифференциально-диагностических сред.

6. Консистенции питательных сред.

7. Питательные среды и дополнительные растворы, используемые в производстве колибактерина.

8. Среды высушивания, применяемые в технологии лиофилизации колибактерина.

9. Стерилизация питательных сред.

10. Режимы стерилизации питательных сред и дополнительных растворов в производстве колибактерина.

11. Технологическое оборудование для приготовления питательных основ и сред.

12. Контрольно-измерительная аппаратура, задействованная на стадии приготовления питательных сред.

13. Физико-химические показатели качества питательных основ и сред, их характеристики.

5. ЛИТЕРАТУРА ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

1. Регламент производства колибактерина сухого № 153-80.- М., 1980.

2. Елинов Н.П. Основы биотехнологии.- С-Пб., 1995.

3. Егорова Т.А. Основы биотехнологии. – М., 2003.

4. Равилов А.З., Гильмутдинов Р.Я., Хусаинов М.Ш. Микробиологические среды.- Казань, 1999.

5. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. Пер. с англ. С.Л. Мехедова; Под ред. В.Г. Дебабова. - М., 1987.

6. Бакулин М.К. Приготовление питательных сред и подготовка посуды для культивирования микроорганизмов. Виды питательных сред. - Киров, 1997.

Содержание