Тема заняття № 6. β-окислення та біосинтез жирних кислот. Дослідження обміну кетонових тіл

Цілі заняття:

 Трактувати β-окислення вищих жирних кислот.

 Трактувати біосинтез вищих жирних кислот та регуляцію процесу біосинтезу на рівні ацетил-КоА- карбоксилази та на рівні синтетази жирних кислот.

 Аналізувати метаболізм кетонових тіл.

 Пояснювати механізми надмірного зростання вмісту кетонових тіл при цукровому діабеті та голодуванні.

Теоретичні питання

1. β-окислення вищих жирних кислот:

• локалізація процесу β- окислення жирних кислот;

• активація жирних кислот. Роль карнітину в транспорті жирних кислот в мітохондрії;

• послідовність ферментативних реакцій β-окислення жирних кислот;

• енергетика β-окислення жирних кислот;

2. Механізм окислення гліцеролу, енергетика цього процесу.

3. Біосинтез вищих жирних кислот:

• локалізація біосинтезу вищих жирних кислот;

• метаболічні джерела синтезу жирних кислот;

• стадії синтезу насичених жирних кислот;

• характеристика синтетази ВЖК, значення ацилтранспортуючого білка, біотину;

• джерела НАДФН, необхідного для біосинтезу жирних кислот;

• послідовність ферментативних реакцій біосинтезу вищих жирних кислот;

• регуляція процесу біосинтезу на рівні ацетил-КоА- карбоксилази та на рівні синтетази жирних кислот;

• елонгація насичених жирних кислот;

• утворення ненасичених жирних кислот.

4. Метаболізм кетонових тіл:

• ферментативні реакції біосинтезу кетонових тіл;

• реакції утилізації кетонових тіл, енергетичне значення;

• метаболізм кетонових тіл в умовах патології. Механізми надмірного зростання вмісту кетонових тіл при цукровому діабеті та голодуванні;

• поняття – кетоацидоз, кетонемія, кетонурія;

• принципи методів визначення кетонових тіл в крові та сечі,

значення виявлення кетонових тіл для медицини;

• виявлення ацетону йодоформною реакцією. Написати цю реакцію.

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення глюкози в зразках сечі № 1-4. Метод Фелінга.

Широко застосовувані методи виявлення та кількісного визначення цукру в біологічних рідинах, особливо в сечі, грунтуються на редукуючих властивостях глюкози.

Метод Фелінга.

Принцип методу. Реакція заснована на властивості глюкози, завдяки наявності альдегідної групи, при нагріванні в лужному середовищі окислюватися, відновлюючи при цьому блакитний гідроксид міді (II) Сu (OH)2 в жовтий гідроксид міді (I) Сu (OH). При подальшому нагріванні утворюється оксид міді (I) Cu2O цегляно-червоного кольору.

Реактив Фелінга, що використовується в реакції, отримують при змішуванні рівних кількостей розчинів сульфату міді (розчин Фелінга I) і лужного розчину сегнетової солі (розчин Фелінга II). В результаті взаємодії сульфату міді з лугом утворюється гідроксид міді (II), що одразу вступає в реакцію з сегнетовою сіллю з утворенням темно-синього розчину мідно-винного комплексу (розчину Фелінга).

Весь гідроксид міді (II) в реактиві Фелінга комплексно зв’язаний з сегнетовою сіллю, що протидіє утворенню з нього при нагріванні чорного осаду оксиду міді (II) та спотворенню отриманих результатів.

Хід роботи. В пробірку вносять по 10 крапель розчинів Фелінга I і II, змішують, додають 20 крапель досліджуваної сечі, нагрівають до кипіння. Якщо сеча містить глюкозу, випадає жовтий осад CuOH або цегляно-червоний Cu2O, інтенсивність забарвлення яких і кількість залежать від концентрації глюкози в досліджуваному зразку.

Клініко-діагностичне значення. Наявність глюкози в сечі (глюкозурія) свідчить про підвищення рівня глюкози в крові вище 10 ммоль/л (нирковий поріг для глюкози). Глюкоза в сечі появляється при цукровому діабеті, аліментарній гіперглікемії, збудженні ЦНС, ураженні нирок, гіпертиреозі, акромегалії тощо.

Завдання 2. Визначення кетонових тіл в зразках сечі № 1-4.

Принцип методу. Ацетон та ацетооцтова кислота з нітропрусидом натрію в лужному середовищі утворюють продукти реакції, забарвлені в червоний колір:

CH3 – CO – CH3 + Na2 [Fe (CN)5 NO] + 2NaOH →

→ Na4 [Fe (CN)5 NO =CHCOCH3] +2H2O.

При дії концентрованої оцтової кислоти утворюється продукт вишнево-червоного кольору:

Na4 [Fe (CN)5 NO =CHCOCH3] +CH3COOH →

Na3 [Fe (CN)5 NOCH3COCH3] + CH3COONa.

Ацетооцтова кислота (в енольній формі) здатна також утворювати з хлоридом заліза (III) комплексну сполуку вишнево-червоного кольору.

Хід роботи. 1. Реакція з нітропрусидом натрію (проба Легаля). В 4 пробірки наливають по 0,5 мл досліджуваної сечі, додають по 0,5 мл розчину гідроксиду натрію і 5-7 крапель нітропрусиду натрію. Спостерігають за появою червоного забарвлення, що приймає вишневий відтінок після додавання декількох крапель концентрованої оцтової кислоти.

2. Реакція с хлоридом заліза (III).

В 4 пробірки наливають по 2,0 мл досліджуваної сечі і додають по краплям 10%-й розчин хлориду заліза (III) до припинення утворення осаду фосфатів. Осад відфільтровують, до фільтрату додають ще декілька крапель FeCl3 та спостерігають за появою вишневого забарвлення.

Завдання 3. Виявлення β-оксимасляної кислоти в зразках сечі.

Принцип методу заснований на окисленні β-оксимасляної кислоти в ацетооцтову після видалення наявних в сечі ацетону і ацетооцтової кислоти. Ацетооцтову кислоту, яка утворилася в результаті окислення, виявляють характерними реакціями.

Хід роботи. В хімічні склянки наливають по 10,0 мл досліджувальної сечі, додають по 10,0 мл води і по 3-4 краплі оцтової кислоти. Склянки ставлять на киплячу водяну баню і випаровують до половини об’єму. Після охолодження в склянки додають по 1,0 мл 3% розчину Н2О2, нагрівають до кипіння і знову охолоджують.

Вміст кожної склянки ділять на 2 частини і проводять визначення ацетооцтової кислоти реакціями з нітропрусидом натрію і з хлоридом заліза (III), як описано вище.

Завдання 4. Виявлення ацетону в зразках сечі № 1-4 експрес-методом.

Техніка роботи. Краплю досліджуваної сечі наносять на індикаторну таблетку рожевого кольору. Поява фіолетового кольору індикатора буде свідчити про наявність ацетону в сечі.

Клініко-діагностичне значення. Збільшення кількості кетонових тіл у крові (кетонемія) і появу їх у сечі (кетонурія) спостерігають при цукровому діабеті, тиреотоксикозі, ураженні печінки, важких інтоксикаціях, голодуванні.

Отримані результати занести до таблиці і зробити загальні висновки.

Досліджувана сеча Результати проведених реакцій

З реактивом Фелінга З нітропрусидом натрію З FeCl3 на β-оксимасляну кислоту На ацетон експрес-методом

№ 1

№ 2

№ 3

№ 4

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія.- Київ-Тернопіль: Укрмед-книга, 2000.-508 с.

2. Биологическая химия. Практикум. За редакцией д.мед.н., профессора

Ю.В. Хмелевського. – Київ: “Вища школа”. – 1985. – 207 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. – Київ:НМУ. – 1992.- 36с.

Додаткова:

1. Алимов Е.К., Аствацатурьян А.Т., Жаров Л.В. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний.-Москва «Медицина», 1975.-278 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.

Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

3. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. Москва «Медицина»-1983.-272 с.

4. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т.-М.: Мир. 1985. – 1056 с.