Завдання 3. Дослідити функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення СО2 та вплив малонової кислота на цей процес

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується утворенням СО₂. В якості джерела ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруват-дегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО₂ не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Для зв’язування СО₂, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)₂. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО₂ визначають по виділенню бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сірчаної кислоти.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв. при 37^оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0 мл 0,1 м розчину H₂SO₄ і спостерігають за вивільненням бульбашок СО₂

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.