Завдання 1. Провести виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація)

Принцип методу. Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях протікають реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилювання. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, компоненти дихального ланцюга вбудовані у внутрішню мембрану мітохондрій.

Для виділення мітохондрій м’язову тканину розтирають (гомогенізують) у механічному гомогенізаторі з тефлоновим пестиком, додаючи розчин сахарози. Виділення мітохондрій з гомогенату здійснюють на рефрижераторній центрифузі. Гомогенат переносять в центрифужні пробірки і поміщають в ротор центрифуги. Швидкість осадження частинок під дією відцентрової сили залежить від їх маси та розміру. В залежності від швидкості обертання ротора і часу центрифугування будуть осаджуватись певні частинки.

Матеріали і реактиви: свіжі м’язи кроля; розчин № 1 – середовище для виділення мітохондрій (0,25 М розчин сахарози і 0,01 М розчин етилендиамінотетраоцтової кислоти (ЕДТО – для зв’язування кальцію) з рН = 7,6); розчин № 2 – середовище для отримання суспензії мітохондрій (0,25 М розчин сахарози в 0,02 М розчині трис-буфера з рН = 7,5). Всі розчини охолоджують до + 2^оС.

Хід роботи. Тканину м’язівочищають від жиру, подрібнюють, зважують та гомогенізують в десятикратному об’ємі охолодженого розчину № 1 протягом 40 хвилин при швидкості обертання пестика – 600 об/хв. Всі подальші процедури проводять при температурі +1-2^оС. Гомогенат звільняють від ядер та обривків клітинних мембран шляхом центрифугування протягом 6 хв. при 700g. Отриману надосадову рідину (супернатант) переносять в інші центрифужні пробірки та повторно центрифугують потягом 10 хв. при 7000g.

Після видалення надосадової рідини отримують осад мітохондрій. Для очищення мітохондрій, додають вихідну кількість розчину № 1, осад ресуспендують а затим проводять повторне осадження мітохондрій протягом 10 хв. при 7000g. Отриманий осад мітохондрій ресуспендують в невеликому об’ємі розчину № 2, визначають вміст білка та використовують для вивчення функціонування ЦТК, тканинного дихання та окисного фосфорилювання.