Главная Случайная страница


Полезное:

Как сделать разговор полезным и приятным Как сделать объемную звезду своими руками Как сделать то, что делать не хочется? Как сделать погремушку Как сделать неотразимый комплимент Как противостоять манипуляциям мужчин? Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами Как сделать идею коммерческой Как сделать хорошую растяжку ног? Как сделать наш разум здоровым? Как сделать, чтобы люди обманывали меньше Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили? Как сделать лучше себе и другим людям Как сделать свидание интересным?

Категории:

АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника







МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ






Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одна из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Гены, которые нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помо­щью той же рестриктазы, поэтому его «липкие концы» являются ком­плементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазми- ды. Ферментом лигазой «сшивают» оба конца ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии называются кло­ном и содержат в плазмидах чужеродный ген, способный вырабатывать белок, кодируемый этим геном. Весь процесс получения таких бакте­рий, называют клонированием. Он состоит из последовательных ста­дий (см. рис. 4.1):

1. Рестрикции - разрезания ДНК человека рестриктазой на мно­жество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же ре- стриктазой.

2. Лигирования - включения фрагмента ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию «липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформации - введения рекомбинантных плазмид в бакте­риальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Их разде­ляют, используя определенную питательную среду (например, раствор антибиотика). Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининга - отбора среди клонов трансформированных бакте­рий тех, которые сохраняют плазмиды, несущие ген человека.

Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью ре- стриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей или не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктаза- ми. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с выре­зания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и- РНК, которая является транскрипционной копией этого гена, и с помо­щью фермента - обратной транскриптазы (ревертазы) - синтезируют комплементарную цепь ДНК, после чего и-РНК, служащая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой (ДНК-полимераза) ком­плементарной второй цепи ДНК. Получаемая двойная спираль ДНК но­сит название к-ДНК (комплементарная ДНК), она соответствует гену, с которого была считана и-РНК. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которая трансформирует бактерии, и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.


Рис. 4.1. Введение гена в плазмиду Escherichia coli и клонирование этого гена в клетках кишечной палочки Плазмида E.coli расщепляется рестрикционной эндонуклеазой в специфическом участке в обеих цепях ДНК, так что на концах расщепленной плазмиды располагаются короткие неспаренные последовательности дезоксирибону- клеотидов (ТТАА или ААТТ), т. е. по четыре нуклеотида, в которых основания представлены тимином и аденином. Ген, который нужно встроить в плазмиду, выщепляют с помощью этой же рестриктазы, так что его концы яв­ляются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают вместе с помощью лигазы. Затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку E.coli,которая, размножаясь, образует клон, все клетки которог содержат рекомбинантную плазмиду, а поэтому и чужеродный ген. Последний теперь клонирован в клетках кишечной палочки и индуцирует в ней синтез специфиче- скогобелка.


4.3. ПОЛУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

4.3.1. Биосинтез инсулина человека в клетках кишечной палочки

Инсулин - это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата. Последний, окисляясь, обеспе­чивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует перифе­рическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит рас­пад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активиро­вание синтеза жиров и белков. При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание - диабет; при этом разрушается нормальный об­мен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние - диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учиты­вая, что поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800-1000 кг исходного сырья. Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, толь­ко 4 млн получали препарат инсулина.

Инсулин построен из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот, последовательность которых была установлена Сэн- гером в 1955 г. Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены тремя коллективами исследователей в Сша, Китае и ФРГ в 1963 и 1965 гг. Однако осуще­ствить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Тем не менее в 1980 г. в Дании (компанией «Ново индастри») был раз­работан способ превращения инсулина свиньи в инсулин человека за­мещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в це­пи В на остаток треонина. Это удалось достигнуть путем ферментатив­ного замещения с последующей хроматографической очисткой продук­та; в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. Исследования двух однокомпонентных инсулинов (чело­веческого и свиного) показали, что они не различались по активности и по времени действия. В 1982 г. инсулин производили главным образом две компании «Эли Лилли» (85 % сбыта инсулина в США и патент на его производство с 1923 г.) и «Ново индастри» (47,5 % сбыта гормона в Европе).

В организме животного две полипептидные цепи инсулина ис­ходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 амино­кислот - препроинсулина. При синтезе препроинсулина в клетках под­желудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для про­хождения молекулы сквозь мембрану клетки; эти аминокислоты отщеп­ляются, образуется проинсулин длиной 86 аминокислот. Молекула про- инсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется с по­мощью ферментов. Так образуется инсулин. Роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсули­на.

Гилберт с сотрудниками выделили и-РНК из поджелудочной же­лезы крысы, синтезировали ДНК-копию (комплементарная ДНК), кото­рая была встроена в плазмиду E. coli в среднюю часть гена пеницилли- назы (этот фермент в норме секретируется из клеток), и получили ре- комбинантную плазмиду. Как показало определение последовательно­сти ДНК, рекомбинантная плазмида содержала информацию о структу­ре проинсулина, но не препроинсулина. При трансляции и-РНК в клет­ках кишечной палочки синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Далее отщепляли пенициллиназу и удаляли средний сегмент проинсулина действием трипсина. Позднее было показано, что полученные таким образом мо­лекулы влияют на сахарный обмен, как гормон, выделенный из подже­лудочной железы крысы.

В 1979 г. в США были синтезированы гены, кодирующие А и Б цепи инсулина. Далее каждый синтетический ген встраивали в плазми- ду E. coli в конце гена -галактозидазы. После этого синтезированные полипептиды отщепляли от фермента, проводили их очистку и цепи со­единяли in vitro для получения полной молекулы инсулина.

В клетках E. coli был также осуществлен биосинтез проинсулина, а не только отдельных ее цепей. Для этого на и-РНК проинсулина син­тезировали ее ДНК-копию с помощью обратной транскриптазы (ДНК- полимераза). Этот способ имеет серьезное преимущество, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены к миниму­му. С помощью этого метода был получен высокий выход гормона - 200 г на 1000 л культуральной жидкости (это эквивалентно количеству инсулина, выделенного из 1600 кг поджелудочной железы животных).

Исследователям из компании «Генентек» потребовалось 10 меся­цев, чтобы в сентябре 1978 г. получить инсулин человека в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Этот инсулин прошел самые серьезные и длительные испытания, которые показали, что он не вызывает никаких побочных явлений, как инсулин животных (у одного из каждых 20-ти больных инсулин животных вызывает аллергию; часто наблюдаются также расстройства почек и зрения ). Кроме того, при длительном применении препарат не вызывал отрицательных иммуно­логических реакций.

Технология производства инсулина в бактериальных клетках име­ет огромные преимущества перед получением инсулина из поджелу­дочной железы животных: не зависит от перебоев или количества сы­рья, конечный продукт всегда имеет одинаковый состав и степень чи­стоты.

В октябре 1982 г. был налажен выпуск «хемулина» (препарата синтетического инсулина человека) фирмой «Эли Лилли», которая за­тратила 100 млн долларов, чтобы начать поставку продукта на рынок.

4.3.2. Биосинтез соматотропина и других гормонов человека

Гормон роста человека, или соматотропин, синтезируется в го­ловном мозге человека в передней доли гипофиза. Впервые он был вы­делен из трупного материала и очищен в 1963 г. При недостатке сома- тотропина развивается гипофизарная карликовость, частота встречаемо­сти которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек. Гор­мон обладает видовой специфичностью, т. е. в отличие от инсулина гормоны роста животных не имеют активности в организме человека. Следовательно, единственным средством излечения гипофизарной кар­ликовости является гормон гипофиза, который выделяли из трупов. Ис­следования показали, что при внутримышечном введении соматотропи- на в дозах 10 мг на 1 кг массы в течение года по три инъекции в неделю дает увеличение роста примерно на 8-18 см в год. Больные дети четы- рех-пяти лет при непрерывном лечении догоняли в росте своих сверст­ников к половой зрелости (14-16 лет).Если учесть тот факт, что из од­ного трупа можно получить 4-6 мг соматотропина, то можно понять, что лечение этого заболевания природным соматотропином - дело со­вершенно безнадежное. Помимо недостатка препарата возникли и дру­гие проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала. Существовала также опасность, что гипофизарный материал заражен медленно развивающимися вирусами. Такие вирусы обладают необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Гормон роста человека, синтезированный в специально сконстру­ированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он до­ступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.

Биосинтез соматотропина (состоящего из 191-го аминокислотного остатка) специально сконструированными бактериями на основе ки­шечной палочки был осуществлен фирмой «Генентек». Поскольку при синтезе ДНК на и-РНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, не расщепляющийся в бактериальных клетках с образо­ванием активного гормона, то поступили следующим образом: на 1 эта­пе клонировали двунитевую ДНК-копию и-РНК и расщеплением ре- стрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23-х первых аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклео- тид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фраг­мента объединили вместе и «подстроили» в плазмиду E. coli, после чего клетки бактерии начали синтезировать этот гормон.

К 1980 г. были закончены клинические испытания препарата и те­сты на токсичность и были начаты массовые эксперименты на детях, близких по возрасту к половой зрелости. Результаты были обнадежива­ющими, и синтетический соматотропин с 1982 г. начал производиться в промышленном масштабе.

Еще один гормон, b-эндорфин - опиат мозга, состоящий из 31-й аминокислоты, - был синтезирован в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. В 1980 г. австралийский ученый Шайн и американские ученые Феттес, Лэн и Бакстер успешно клонировали ДНК, кодирующую b-эндорфин, в клетках E. сoli и получили этот поли­пептид в виде слитного белка с ферментом b-галактозидазой. На первом этапе они клонировали фрагмент ДНК, полученный в результате обрат­ной транскрипции и-РНК, кодирующей b-эндорфин, и далее встраивали его в плазмиду E .coli за геном b-галактозидазы, при этом получили ги­бридный белок, состоящий из b-галактозидазы и b-эндорфина; далее ферментативно отщепляли b-галактозидазу, получая биологически ак­тивный b-эндорфин.

4.3.3. Получение интерферонов

Еще одним замечательным достижением генной инженерии явля­ется синтез интерферона.

Впервые интерферон был получен в 1957 г. в Национальном ин­ституте медицинских исследований вблизи Лондона. Это белок, кото­рый выделяется в очень низких количествах клетками животных и че­ловека при попадании в организм вирусов и направлен на борьбу с ни­ми. Первые же исследования выявили высокую биологическую актив­ность интерферона при лечении гриппа, гепатита и даже раковых забо­леваний (подавляет размножение аномальных клеток). Интерферон, как и соматотропин, обладает видовой специфичностью: интерфероны жи­вотных неактивны в организме человека и даже отторгаются им.

В организме человека вырабатывается несколько видов интерфе- ронов: лейкоцитарный (а), фибробластный (b) и иммунный (g) (Т- лимфоцитарный).

Природные интерфероны получают из крови человека с крайне низким выходом: в 1978 г. в Центральной лаборатории здравоохранения в Хельсинки ( в то время мировой лидер в получении лейкоцитарного интерферона ) из 50-ти тысяч литров крови было получено 0,1г чистого интерферона.

Процесс получения интерферонов в основных чертах был одина­ков для всех типов клеток, выращиваемых в культурах и образующих интерферон. Клетки крови заражали вирусом Сендай и через 24 ч филь­тровали на суперцентрифуге. В надосадочной жидкости содержался грубый препарат интерферона, который подвергали хроматографиче- ской очистке. Стоимость препарата была очень велика - 400 г интерфе­рона стоил 2,2 млрд долларов. Однако перспективность фармакологиче­ского его использования (в том числе против четырех видов рака) за­ставляла искать новые пути его получения, в первую очередь с помо­щью генной инженерии.

В январе 1980 г. был получен интерферон человека в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. Исходная трудность при этих методах заключалась в том, что и-РНК интерферонов мало да­же в лейкоцитах, стимулированных заражением вирусов, и в том, что выходы были очень низкие: сообщалось о получении 1-2 молекул ин­терферона на одну бактериальную клетку. В 1981 г. фирме «Генентек» удалось сконструировать рекомбинантную ДНК, кодирующую g- интерферон, и ввести ее в геном бактерий, дрожжей и даже клетки мле­копитающих, и они стали способными синтезировать интерферон с большим выходом - 1 л культуры клеток дрожжей содержал 1 млн еди­ниц интерферона (единица интерферона соответствует такому его коли­честву, которое защищает 50 % клеток в культуре от заражения виру­сом). Процесс был осуществлен следующим образом: исследователи выделили смесь молекул и-РНК из лимфоцитов человека, получили мо­лекулы соответствующих ДНК-копий и ввели их в клетки E. coli. Далее были отобраны бактерии, продуцирующие интерферон.

4.3.4. Получение иммуногенных препаратов и вакцин

Другая область применения генной инженерии связана с получе­нием новых эффективных, безопасных и дешевых вакцин.

Вакцины - одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять осо­бое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не уда­лось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения мно­гих распространенных или опасных инфекционных заболеваний.

Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболе­ваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественные новообра­зования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10-15 лет правительства многих стран стали принимать меры, направленные на интенсивную разработку и произ­водство принципиально новых вакцин.

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:

- живые аттенуированные вакцины;

- инактивированые вакцины;

- вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганиз­мов (протеины или полисахариды);

- рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микро­организмов, полученные методом генной инженерии.

Технологию рекомбинантных ДНК применяют также для созда­ния живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации пу­тем направленной мутации генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получе­ния живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие им- муногенные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в орга­низм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют иначе генными или генетическими.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию имму- ногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бакте­риальную плазмиду. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий проте­ин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходи­мы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое ко­личество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очи­щают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чуже­родных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбу­дителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с тра­диционными вакцинами:

- способствуют выработке антител к нативной молекуле вирус­ных протеинов;

- способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов;

- могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-лимфоцитов;

- способствуют формированию длительного иммунитета;

- устраняют риск инфицирования.

4.3.5. Другие области применения генной инженерии








Date: 2015-09-24; view: 277; Нарушение авторских прав

mydocx.ru - 2015-2017 year. (0.013 sec.) - Пожаловаться на публикацию