Выделение и химический состав S-слоев

Большинство методов, используемых для выделения и очистки S-слоев, включают механическую дезинтеграцию клеток с последующим дифференциальным центрифугированием для разделения фрагментов клеточных поверхно­стных структур (Koval et al., 1997; Sleytr et al., 1997, 1999). Полученный грубый препарат клеточных поверхностных структур обрабатывается нуклеазами и детергентами, такими, например, как Тритон Х-100, так как последний способен селективно солюбилизировать присут­ствующие в препарате фрагменты цитоплазматической мембраны (Baumeister et al., 1992; Sara et al., 2000). Для удаления пептидогликана применяют, как правило, обработку лизоцимом (Phipps et al., 1991; Peters et al., 1996).

Для экстракции S-слоя используют как растворы с низкими концентрациями хаотропных агентов (0,5 М мочевина, 1,5 М ГГХ), так и концентрированные растворы этих соединений и некоторых детергентов (8 М мочевина, 5 М ГГХ, 2%-ный раствор ДСН), а также хелатирующие агенты (Messner et al., 1990, 1992; Walker et al., 1992). За экстракцией, как правило, следует очистка белков S-слоя с помощью колоночной хроматографии на сефарозе CL-6B в 5 М растворе гуанидингидрохлорида (Sleytr et al., 1997). Возможна также хроматография на ДЕАЕ-сефарозе.

Важно отметить, что S-слои могут значительно отличаться по химической устойчи­вости и стабильности. Это обстоятельство следует учитывать в первую очередь при разработке способов их выделения. В ряде случаев используют особые нестандартные методы выделения S-слоев (Walker et al., 1992; Berson et al., 1997; Fjellbirkeland et al., 2000, 2001). Так, S-слой Methanococcus voltae был солюбилизирован в горячем (50^оС - 60°С) буфере HEPES (Koval et al., 1997). Обработка клеток HEPES-буфером при рН 2 наиболее эффективна для селективного выделения почти чистого белка S-слоя из клеток Caulobacter crescentus CBI5A (Walker et al., 1992). Белок S-слоя Lactobacillus helveticus ATCC 12046 эффективно экстрагируется 5 М раствором LiCl (Lortal et al., 1992). S-слой Deinococcus radiodurans способен диссоциировать только в горячем (60°С) 2%-ном растворе додецилсульфата натрия (ДСН) (Baumeister et al., 1992). S-слой термоацидофильной архебактерии Sulfolobus acidocaldarius (темпера­тура роста 70-90°С, рН 0,9–3,5) не солюбилизируется в растворе ДСН при 60°С, но может быть солюбилизирован при нагревании в 0,1 М фосфатном буфере рН 9,0. S-слои Sulfolobus solfataricus и Sulfolobus brierleyi гораздо более ла­бильны и лизируют в растворах ДСН при 60°С. S-слой Thermoproteus tenax (температура роста 90°С) не солюбилизируется даже в кипящих растворах ДСН в диапазоне рН 3-11, а у Руrоdictium occultum (температура роста 100–110^оС) диссоциация S-слоя происходила в растворах ДСН только при 100°С. По всей вероятности, такая необычная термостабильность необходима для жизни при экстремальных температурах.

Исследования, связанные с выделением S-слоев, их химической устойчивостью и способностью к дезинтеграции на составляющие протомеры, показали, что белковые субъединицы в S-слоях грамположительных и грамотрицательных бактерий взаимосвязаны, как правило, между собой и с другими компонентами клеточ­ной стенки не ковалентной связью, а через водо­родные связи, ионные связи, гидрофобные взаи­модействия или их различные комбинации (Сузина и др., 1986; Sleyrt et al., 1997; Гальченко, 2001). Отмеченная в ряде публикаций необыч­ная химическая стабильность S-слоев Руrodictium occultum и Thermoproteus tenax свиде­тельствует о том, что субъединицы данных бел­ков связаны, по всей вероятности, ковалентно. Структурная целостность и устойчивость неко­торых S-слоев обеспечивается присутствием в них одно- или двухвалентных катионов (Beveridge et al., 1997; Karlsen et al., 2003, 2005).

Химический анализ S-слоев у эубактерий и архебактерий показал, что большинство этих по­верхностных структур состоит из одного высоко­молекулярного полипептида с возможным при­сутствием в нем ковалентно связанного углевода в качестве минорного компонента (Sara et al., 1996, 1998, 2000; Ries et al., 1997; Riedmann et al., 2003; Rothfuss et al., 2006).

Молекулярная масса мономеров, определенная с помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ), варьирует в пределах 40-200 kДа. Однако даже чистые пре­параты S-слоя выявляют в геле, как правило, более чем одну полосу. Это можно объяснить следующими причинами: 1) присутствием двух тесно ассоциированных S-слоев, состоящих из различных видов субъединиц; 2) протеолитическим расщеплением субъединиц S-слоя in vivo или в процессе выделения; 3) разницей в степени гликозилирования гликопротеиновых субъединиц S-слоя (Koval et al., 1997; Sillanpa et al., 2000; Sara et al., 2000).

Конформационные исследования были проведены только на очень немногих белках S-слоев. Изучение вторичной структуры этих белков методом кругового дихроизма, показа­ло низкое содержание α-спиральной струк­туры (2-14%), 20-35% β-структуры и высокий уровень непериодической структуры (Phipps et al., 1991).

Не выявлены значительные раз­личия в аминокислотнм составе белков S-слоя у эу­бактерий и архей. Кислотные свойства этих белков оп­ределены по низкой изоэлектрической точке (pI), которая обычно находится в пределах рН 4,0 – 6,0 (Smid, 1996). Для белков S-слоев характерно высокое со­держание неполярных и кислых аминокислот, а также небольшое количество или полное отсут­ствие серосодержащих аминокислот (Северина с соавт., 1995; Sleytr et al., 1999; Sara et al., 2001). Следует отметить, что подобный аминокислотный состав характерен для боль­шинства внеклеточных белков. По сравнению с другими прокариотами аминокислотный состав белка S-слоя этой термоацидофильной архебактерии отлича­ется низким содержанием кислых и основных аминокислот, но и высоким уровнем оксиаминокислот, серина и треонина (Sara et al., 2000).

К настоящему времени клонировано и секвенировано более 40 генов S-белков из различных микроорганизмов (Messner et al., 2008; Jarrell et al., 2010). Однако до сих пор не удалось получить кристаллы какого-либо белка, пригодные для рентгеноструктурного анализа и точная пространственная структура ни одного S-белка пока не известна.

При росте бактерии с продолжительностью клеточного цикла 20 мин, должно синтезироваться ~ 500 молекул белка S-слоя за одну секунду, что свидетельствует об эффективности промоторов соответствующих генов. Действительно, как показал анализ последовательности генов S-слоев, они обладают весьма эффективными промоторами. Так, у Lactobacillus acidophilus промотор белка S-слоя по эффективности почти вдвое превосходит промотор лактатдегидрогеназы, который считается одним из самых сильных бактериальных промоторов (Boot et al., 1999). Время полураспада мРНК этого белка составляет 15 мин. Такая же высокая стабильность (время полураспада 14 мин) характерна для мРНК, кодирующей S-белок Lacto­bacillus brevis (Palva, 1997), при том, что среднее время по­лураспада мРНК у бактерий составляет 2-4 мин. Несмотря на столь интенсивный синтез S-белки отсутствуют в среде культивирования, т.е. имеется строгая регуляция синтеза и согласова­ние его с клеточным ростом. К сожалению, дан­ных о молекулярных механизмах регулирования активности генов, кодирующих S-белки, очень немного.

Наиболее полно регуляция исследована в случае гена slpA, кодирующего S-слой у термо­фильной бактерии Thermus thermophilus HB8 (Fernandez-Herrero et al., 1997a). Был обнаружен ген slpA, продукт которого реп­рессирует транскрипцию slpA, но механизм этой репрессии неизвестен. Особенно интересно то, что белок SlpA может связываться с мРНК slpA и таким образом контролировать собственную трансляцию (Fernandez-Herrero et al., 1997b). S-слой Clostridium difficile состоит из двух различных белковых субъединиц. Последние являются кис­лыми белками и не содержат пролина и цистеина. Пептидные карты этих субъединиц сущест­венно отличаются, что указывает на различие их первичных структур (Sleytr et al., 1997).

В сравнении с мезофилами, S-слои термо­фильных микроорганизмов имеют несколько бо­лее высокое содержание гидрофобных и основ­ных аминокислот (Sleytr et al., 1997). Следует отметить, что при высоком содержании неполярных аминокис­лот гидрофобные взаимодействия повышают стабильность S-слоев. Сообщалось о том, что взаимодействие кислых аминокислот с двухвалентными катионами способствует ста­бильности S-слоев (Olabarría et al., 1996; Sleytr et al., 1997). Различные условия культивирования практически не влияли на аминокислотный состав белков S-слоя (Sara et al., 2000). Если по аминокислотному составу белки S-слоя проявляли значительное сходство, то углеводная часть гликопротеинов может быть весьма разнообразной. Присутствие углеводного компонента можно выявить колориметрически­ми методами, в том числе специфическим окра­шиванием в ПААГ (Koval et al., 1997). Обыч­но белки S-слоя содержат до 10% углевода, кото­рый чаще всего является гетерополисахаридом (Peters et al., 1996; Sleytr et al., 1997). Так, углевод, входящий в состав гликопротеина S-слоя Clostridium thermohydrosulfuricum LIII-69, состоит из рамнозы и маннозы (Sleytr et al., 1997). В состав углеводной части S-слоя Bacillus stearothermophilus NRS 2004/3а входят два типа углеводной цепи: одна содержит трисахаридповторяющиеся звенья, состоящие из рамнозы, а вторая - из тетрасахаридповторяющихся звеньев, содержащих глюкозу, N-ацетилглюкозамин и ди-М-ацетилманнуроновую кислоту (Messner et al., 1990, 1992).

Гликопротеин Desulfotomaculum nigrificans NCIB 8706 содержит глюкозу, маннозу, галактозу и рамнозу (Sleytr et al., 1997). В состав углеводной части гликопротеина S-слоя Sulfobacillus thermosulfidooxidans ВКМ-В-1269 входят манноза, глюкоза, ксилоза, галактоза и глюкозамин (Северина с соавт., 1995). Гликопротеин Halobacterium halobium содержит N- и О-связанные гликановые цепи, содержащие галактозу, галактуроновую, глюкуроновую и 3-О-метилгалактуроновую кислоты, а также N-ацетилглюкозамин (Paul et al., 1986). Гликаны подобного строения были обнаружены также в углеводной части S-слоя Halobacterium salinarium (Paul et al., 1987). Углеводная часть гликопротеина S-слоя Clostridium symbiosum HB 25, как было показано Н¹- и С¹³-ЯМР-спектроскопией, является высокомолекулярным полимером с тетрасахаридповторяющимися звеньями, содержащими в своем составе N-ацетилгалактозамин, N-ацетилманнозамин и производное глюкозамина (Messner et al., 1990). Иной вид О-гликозидной связи был обнаружен с помощью Н¹- и С¹³-ЯМР-спектроскопии в гликане гликопротеина S-слоя Clostridium thermohydrosulfuricum S102-70. Оказалось, что β-D-глюкозный остаток "пришит" к белковой части через дополнительную гидроксильную группу тирозина. Полученные данные свидетельствуют о том, что гликозилирование белков S-слоев - обычное явление среди археебактерий и эубактерий. Есть основание предполагать, что углеводная часть гликопротеинов S-слоев играет важную роль в клеточной адгезии, поддержании конформационной устойчивости этих белков и стабилизации полипептида против протеолитической деградации (Sleytr et al., 1997).

Хотя общая гомология между белками S-слоёв уди­вительно низка, однако у грамположительных бактерий имеется в N-концевой части S-белков участок, который обладает достаточно высокой гомологией и получил название SLH-мотива (S-layer homologus) (Engelhardt еt al., 1998; Sara, 2001). Обычно в N-концевой области S-белков (в пределах 200 аминокислот­ных остатков) локализованы три SLH-мотива, каждый из которых содержит консервативную последовательность, состоящую из 10-15 амино­кислот.

Впервые такая последовательность была найдена в S-белке Acetogenium kivui (Lupas et al., 1994) и затем - у Clostridium thermocellum (Lemaire et al., 1998), Thermus thermophilus (Olabarría et al., 1996), Bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы) (Fouet at al., 1997) и у многих других грамположительных бакте­рий (Sara, 1998). Интересно, что SLH-мотив гомологичен участкам в С-концевой части ряда экзоферментов, ассоциированных с клетками грамположительных бактерий. Это, прежде всего, целлюлазы, пулланаза, ксиланаза, т.е. ферменты, участвующие в гидролизе полисахаридов (Leibovitz et al., 1997).

Явление "заякоривания" S-белков на клеточ­ных оболочках с помощью SLH-последовательностей распространено не повсеместно даже для грамположительных бактерий. Так, S-белки В. stearothermophilus (Kuen et al., 1997), Lactobacillus (Callegari et al., 1998), Corynebacterium glutamicum (Chami et al., 1997) не содержат в своей последовательности SLH-мотивов. Облас­ти, ответственные за связывание с клеточной стенкой, у Lactobacillus локализованы в N-конце­вой части S-белков (Callegari et al., 1998), а у Corynebacterium glutamicum - в С-концевой части (Chami et al., 1997). У грамотрицательных бактерий и архей последовательности, ответственные за связывание с поверхностью кле­ток, локализуются как в N-, так и в С-концевых об­ластях (Chami et al., 1997; Dworkin et al., 1997; Callegari et al., 1998). Разнообразие последовательно­стей и способов взаимодействия S-слоев с клеточ­ными оболочками не кажется удивительным, если принять во внимание разнообразие самих этих оболочек. Долго бытовало мнение, что у грамположи­тельных бактерий S-белки связываются с пептидогликаном клеточной стенки (Lupas et al., 1994), но в настоя­щее время экспериментально показано, что S-белки связываются со вторичными полимера­ми клеточной стенки. К вторичным полимерам относят тейхоевые, тейхуроновые, липотейхоевые кислоты, липогликаны, которые соединены с пептидогликаном либо ковалентно, либо нековалентно с помощью липидных молекул (Navarre et al., 1999).

Вначале было показано, что S-белок бактерий В. stearothermophilus SbsB не связывается с чехлом пептидогликана, из которого вторичные полиме­ры удаляли экстракцией плавиковой кислотой. Белок SbsB содержит SLH-последовательность и ее удаление прекращало связывание белка также и с полной клеточной стенкой, содержащей вто­ричные метаболиты (Ries et al., 1997). SLH-мотивы S-белков связывались с тейхуроновыми кислотами кле­точной стенки (Sara, 1998; Ilk et al., 2002). Какие вторичные полиме­ры клеточной стенки ответственны за связыва­ние S-белков, лишенных SLH-последовательностей, еще предстоит выяснить (Sara, 1998).