Главная Случайная страница


Полезное:

Как сделать разговор полезным и приятным Как сделать объемную звезду своими руками Как сделать то, что делать не хочется? Как сделать погремушку Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами Как сделать идею коммерческой Как сделать хорошую растяжку ног? Как сделать наш разум здоровым? Как сделать, чтобы люди обманывали меньше Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили? Как сделать лучше себе и другим людям Как сделать свидание интересным?


Категории:

АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника






Биотехнологические основы культивирования микроорганизмов. 6 page





5. Для трансгеноза используют также искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), несущие множество генов. Напомним, что дрожжи – это эукариотические клетки, в которых возможна посттрансляционная модификация белков. Таким образом были получены мыши, синтезирующие только человеческие антитела. Их использовали в качестве модельных систем для изучения генетических болезней человека (например, болезни Альцгеймера).

Трансгенные сельскохозяйственные животные. Для создания трансгенных коров использовали схему трансгеноза методом микроинъекций ДНК:

- Отбор ооцитов коров, забитых на скотобойне.

- Созревание ооцитов in vitro.

- Оплодотворение бычьей спермой in vitro.

- Центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа.

- Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус.

- Развитие эмбрионов in vitro.

- Нехирургическая имплантация одного эмбриона реципиентной самке во время течки.

- Скрининг ДНК потомков на наличие трансгена.

В тестовых экспериментах из пула в 2470 ооцитов были получены два трансгенных теленка. Метод дает результат, но пока характеризуется низкой эффективностью.

Трансгеноз крупного рогатого скота может преследовать следующие цели:

- Изменение содержания в молоке различных его компонентов. Например, увеличение доли капа-казеина позволит увеличить получение сыра.

- Введение гена лактазы позволит получить молоко, в котором разрушена лактоза. Такое молоко могут употреблять в пищу люди с дефектоп лактазы пищеварительного тракта (непереносимость молока).

- Выведение животных, устойчивых к вирусным и бактериальным инфекциям, а также к паразитарным инвазиям. Разрабатываются методы введения генов, ответственных за продукцию белков неспецифической и иммунной резистентности.

- Использование молочной железы коров как биореактора. Предположим, что корова дает в год 10000 л молока, содержащего 35 г белка в 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. Примерно столько белка С требуется ежегодно, например, для предотвращения тромбообразования в сосудистом русле больных людей.

Трансгенные овцы и козы создавались для биосинтеза и секреции в молоко белков человека: активатор плазминогена, антитрипсин, фактор IХ системы свертывания крови, лактоферрина, урокиназы, интерлейкина-2 и др. В отличие от трансгенных бактерий-прокариот, в молочных железах-биореакторах достигалась посттрансляционная модификация человеческого белка, в частности – гликозилирование. Были созданы трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Удалось создать трансгенных свиней, способных синтезировать человеческий гемоглобин.

Большой интерес представляет ксенотрансплантация клеток и тканей животных человеку. Например, трансплантация гормонпродуцирующих клеток инсулярного аппарата поджелудочной железы больным диабетом. Основная проблема таких операций заключается в остром отторжении ксенотрансплантата за счет активации комплемента. Были созданы трансгенные свиньи, пересаживаемые клетки которых содержали гены ингибиторов комплемента. Благодаря их экспрессии синтезировались белки, предотвращающие острую реакцию отторжения пересаженных человеку клеток свиньи.

Трансгенные птицы и рыбы. Получение трансгенных птиц оказалось достаточно сложной проблемой. В настоящее время трансгенные цыплята воспроизводятся трансфекцией изолированных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародышевую область облученной бластодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансген в клетках зародышевой линии, при скрещивании могут дать начало трансгенным линиям.

Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих пород – для придания им устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызываемым кокцидиями, повышения эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холестерола в яйцах, повышения качества мяса. Было предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источника белковых продуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрессия трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется большое количество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового продукта в яйце, откуда его можно затем выделить.

По мере истощения природных рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рекомбинантной рыбы в искусственных условиях путем трансгеноза. Трансгены вводят микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток. Эмбриогенез рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необходимости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций высокая (35-80%), а доля трансгенных потомков колеблется от10 до 70%. Изучено влияние трансгена гормона роста на скорость роста рыб. Приведем технологию трансгеноза, пригодного «для всех рыб», обитающих в холодной воде. В яйцеклетки атлантического лосося введен трансген, состоящий из следующих элементов:

- промотор гена антифризного белка американской бельдюги;

- кДНК гормона роста лосося;

- сигналы терминации/полиаденилирования 3’-конца гена антифризного белка американской бельдюги.

Полученные трансгенные лососи были крупнее и быстрее прибавляли в весе, чем контрольные нетрансформированные рыбы. Годовалые трансгенные особи, полученные в результате введения в яйцеклетки нерки генетической конструкции гормона роста, весили в 11 раз больше, чем нетрансгенные.

Предполагается, что в будущем гены устойчивости к болезням и стрессовым воздействиям, а также гены, обуславливающие другие биологические особенности, будут введены как рыбам умеренных широт, так и тропическим рыбам.

Имеется надежда, что трансгеноз позволит улучшать генотип существующих пород домашнего скота и выводить породы животных с новыми признаками.

Контроль применения генноинженерных методов. Внедрение молекулярной биотехнологии и генной инженерии сопровождается решением ряда смежных проблем – этических, правовых, экономических и социальных. Уже при возникновении этих наук были высказаны опасения по поводу безопасности технологии рекомбинантных ДНК. Ученым пришлось наложить мораторий на некоторые исследования в этой области до принятия официальных правил работы с рекомбинантными микроорганизмами. Согласно этим правилам, эксперименты можно было проводить только с теми из них, которые неспособны размножаться вне лаборатории, а сами исследователи должны были быть защищены от какой бы то ни было опасности (1974-1975 гг). Широко распространено мнение, что попадание генетически модифицированных организмов в окружающую среду может привести к неконтролируемому распространению их в экосистемах.

Контроль экспериментов с рекомбинантными ДНК. В 1976 г. Национальные институты здравоохранения США (NIH, от National Institutes of Health), финансирующие и координирующие этот тип исследований издали инструкцию, в которой:

- сформулировано требование, чтобы в качестве хозяев для чужеродных ДНК использовались только микроорганизмы, неспособные размножаться и передавать свою ДНК другим микроорганизмам вне лаборатории;

- рекомендовалось работы с патогенными микроорганизмами проводить в боксах с отрицательным давлением;

- предлагалось работы с микроорганизмами проводить в помещениях, оборудованных высокоэффективными системами фильтрации;

- полностью запрещались эксперименты с преднамеренным высвобождением в окружающую среду любых организмов, содержащих рекомбинантную ДНК.

Однако само создание генетически модифицированных организмов (ГМО), способных выживать в природных экосистемах, было неизбежным. И тогда был создан Консультативный комитет NIH по рекомбинантным ДНК (NIH Recombinant DNA Advisory Committee, NIH-RAC). Он должен был контролировать исследования, связанные с рекомбинантными ДНК, и при необходимости изменять действующие правила.

До настоящего времени три проблемы еще не нашли адекватного решения:

- как контролировать производство и потребление пищевых продуктов, содержащих генетически измененные организмы или полученных с их использованием;

- как контролировать преднамеренное высвобождение ГМО в окружающую среду (военные разработки, терроризм);

- как контролировать лекарственные препараты, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

В большинстве стран имеются Центры сертификации и контроля пищевых продуктов и пищевых добавок. Одним из первых такой центр был создан в США – Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA, от Food and Drug Administration). Документы и Правила FDA явились основой для многих национальных Центров сертификации и контроля пищи. Каждый продукт должен пройти тестирование на соответствие ряду специфических критериев в зависимости от своей природы, прежде чем он будет разрешен к употреблению человеком.

Понятие о GMP, GLP и GCP. Для изучения фармакологической активности химических веществ и безопасности их воздействия на человека используют правила GLP и GCP.

1. Правилах добротного и безопасного производства (GMP – Good Manufacturing Practice) включают требования к биотехнологическому производству. Здесь учитываются не только технологические процессы получения рекомбинантных белков и других продуктов, но и безопасность производства.

2. Правила GLP. Начиная с 1976 года, когда в США были впервые предложены правила добротной лабораторной практики (Good Laboratory Practice – GLP), во многих странах происходит совершенствование технологий доклинического испытания ксенобиотиков – потенциальных лекарств и других биологически активных веществ. Основная цель GLP – обеспечение достоверности результатов доклинических испытаний природных и синтетических ксенобиотиков, гарантирующих их безопасность для человека и животных. В 1992 году в России были приняты Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP, ЗВ 64-126-91).

Изучение безопасности ксенобиотиков (новых оригинальных потенциальных лекарственных средств) проводится в полном объеме: общая токсичность (острая, подострая, хроническая, местное раздражающее действие, цитотоксичность), специфическая токсичность (лекарственная зависимость, антигенность, тератогенность, мутагенность, канцерогенность), фармакокинетические исследования (всасывание, распределение, выделение, метаболизм, биодоступность), общефармакологическое действие и пирогенность инъекционных ксенобиотиков.

3. Правила GCP. Правила проведения клинических испытаний химических веществ – лекарственных средств (Good Clinical Practice – GCP) представляют собой международный этический и научный стандарт качества для планирования и проведения исследований на людях, а также документального оформления и представления их результатов. Требования данных правил должны соблюдаться при проведении клинических испытаний лекарственных средств, результаты которых утверждаются государственными органами.

Безопасность пищевых продуктов и пищевых ингредиентов, в том числе добавок, придающих продуктам специфический вкус и запах, должна быть гарантирована еще до получения лицензии, разрешающей их введение в товарооборот и подтверждающей, что такие продукты можно употреблять в пищу. Правила, регламентирующие проведение экспериментов с рекомбинантными ДНК, были разработаны Национальными институтами здравоохранения США в конце 70-х годов прошлого века и пересмотрены спустя 10 лет. В России с 1 июля 1999 г. вступило в силу постановление Министерства здравоохранения РФ «О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников». Согласно этому документу гигиеническая экспертиза пищевых продуктов и продовольственного сырья, а также компонентов (фрагментов) для их производства, полученных из генетически модифицированных источников должна включать определение вносимой последовательности генов, маркерных генов антибиотиков, промоторов, стабильности генетически модифицированных организмов на протяжении нескольких поколений, а также санитарно-химические показатели качества и безопасности, результаты токсикологических исследований на лабораторных животных, оценку аллергенных свойств продукта, возможных мутагенных, канцерогенных и тератогенных эффектов. Кроме этого, обязательна технологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированного сырья – органолептических свойств и физико-химических параметров. В республике Беларусь аналогичные функции выполняет государственное предприятие «Республиканский центр экспертиз и испытаний в здравоохранении». Научные и практические санитарногигиенические исследования ведет сеть областных центров, возглавляемая научно-исследовательским институтом.

Патентование биотехнологических изобретений. Самая важная форма интеллектуальной собственности для биотехнологии – это изобретение. Изобретение охраняется патентом, который представляет собой узаконенный документ, обеспечивающий исключительные права патентовладельца на коммерческое использование изобретения. Традиционно патентуются микроорганизмы, разработаны нормы, согласно которым селекционерам представляются права на новые сорта растений, в США и Европе запатентована трансгенная мышь («онкомышь»), несущая активируемый ген, отвечающий за формирование опухоли, охраноспособными изобретениями считаются растения, полученные с помощью методов генной инженерии.

Геномная инженерия является современной методологией конструирования биотехнологических продуцентов.По В.Н.Рыбчину (2002), геномная инженерия решает проблему целенаправленной наследуемой перестройки какого-либо генома с тем, чтобы сформировавшийся организм существенно отличался по набору признаков от исходного, вплоть до отнесения его к новому виду. Геномную перестройку возможно осуществить следующими способами: 1) внесением в геном значительного количества дополнительной генетической информации; 2) заменой существенной части генома на функционально гомологичную часть другого генома; 3) модификацией ключевых генов с целью воспрепятствовать скрещиваемости с одновидовыми партнерами (для организмов, обладающих половым способом размножения). Целенаправленное конструирование новых геномов требует знания их структуры, понимания принципов их организации, а также учета механизмов взаимодействия генов и их продуктов. В свою очередь одним из методов исследования этих аспектов может служить геномная инженерия.

Рассмотрим некоторые принципы геномного конструирования. Все гены организма можно разделить на облигатные и факультативные, т.е. на обязательные и необязательные для выживания организма в заданных условиях. Чтобы продукт геномной инженерии был жизнеспособным, его геном должен содержать все облигатные гены.

Большинство генов в геноме включено в те или иные регуляторны цепи. Регуляторные механизмы обусловливают поддержание концентрации клеточных продуктов (как в количественном, так и в качественном отношении) на определенном уровне, зависящем от внешних условий (сигналов). Между частями гибридного генома, произошедшими от разных доноров, регуляторные связи в той или иной степени нарушены. Для их восстановления необходимо в определенные гены вводить мутации, создавать новые сайты рецепции регуляторных сигналов, изменять мощность или специфичность некоторых промоторов и др. Следовательно, регуляторные связи между совмещенными в гибридном геноме генами должны быть взаимно согласованы.

Современный уровень знания допускает возможность создания клеток новых видов только путем радикальной модификации избранного родительского типа или путем создания межвидовых гибридов. Согласно принципам геномного конструирования создание жизнеспособных гибридов практически возможно только между эволюционно близкими организмами.

Неограниченные возможности для объединения геномов, включая и геномы эволюционно далеких организмов, открывает техника слияния протопластов в присутствии полиэтиленгликоля. При межвидовой и межродовой гибридизации бактерий и дрожжей таким способом удается получать жизнеспособные гибриды. Но уже здесь проявляется очевидная закономерность: чем отдаленнее скрещиваемые виды, тем реже образуются стабильные гибриды.

Возможности геномной инженерии пока можно проиллюстрировать только примерами растений. Пластичность растений позволяет манипулировать их геномами и даже получать искусственно новые виды. Такие задачи издавна решались в опытах по межвидовой гибридизации. В частности, крупным достижением генетики и селекции стало создание плодовитых растительных гибридов – амфидиплоидов половым путем. На счету клеточной и геномной инженерии получение плодовитых растительных гибридов путем слияния протопластов соматических клеток. Согласно А.Н.Евтушенкову и Ю.К.Фомичеву (2004), растительные протопласты – это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, обладающие внутриклеточными органеллами и характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии. Разработка методов индуцированного слияния протопластов привело к формированию нового и эффективного метода гибридизации растений, получившего название соматической гибридизации. Сущность данной технологии состоит в том, что в качестве гибридизуемых клеток используют не гаметы (репродукционные клетки), а клетки тела растений (соматические), из которых получаются протопласты. Слияние протопластов обеспечивает объединение не только клеточных геномов, но и двух различных цитоплазм. В большинстве известных случаев слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного.

 

Date: 2015-09-27; view: 630; Нарушение авторских прав; Помощь в написании работы --> СЮДА...



mydocx.ru - 2015-2024 year. (0.006 sec.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав - Пожаловаться на публикацию