Основы биотехнологии 1 page

А.А.ЧИРКИН

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Витебск 2009

Министерство образования Республики Беларусь

Учреждение образования «Витебский государственный университет им. П.М.Машерова»

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Учебно-методический комплекс для студентов биологического факультета

Издание второе, дополненное и исправленное

Витебск

Издательство УО «ВГУ им. П.М.Машерова»

2009

УДК 575 (075.8)

ББК 28.04я73

Ч 65

Печатается по решению научно-методического совета учреждения образования «Витебский государственный университет им. П.М.Машерова»

Автор: заведующий кафедрой химии УО «ВГУ им. П.М.Машерова», доктор биологических наук, профессор А.А.Чиркин

Рецензенты: доктор биологических наук, профессор кафедры химии УО «Витебская госудпрственная академия ветеринарной медицины», профессор В.М.Холод

доктор медицинских наук, профессор кафедры химии УО «Витебский государственный университет им. П.М.Машерова», Е.О. Данченко

Чиркин А.А.

Введение в биотехнологию.

Учебно-методический комплекс для студентов биологического факультета / А.А.Чиркин. – Витебск: Издательство УО «ВГУ им. П.М.Машерова», 2009. – 146 с.

ISBN

Учебно-методический комплекс дисциплины «Основы биотехнологии» для студентов Биологического факультета включает программу по биотехнологии, рабочий план, тематику лекций и лабораторных занятий, теоретические основы предмета, лабораторный практикум, вопросы для итогового контроля (зачет). Комплекс призван оказать помощь студентам биологических специальностей в изучении биотехнологии.

УДК 575 (075.8)

ББК28.04я73

ISBN © Чиркин А.А., 2009

© УО «ВГУ им. П.М.Машерова», 2009

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

Учебно-методический комплекс дисциплины «Основы биотехнологии» составлен с ориентацией на конечный результат обучения студентов на биологическом факультете с целью формирования знаний о современных биотехнологических процессах, основанных на методах рекомбинантных ДНК, а также на использовании иммобилизованных ферментов, клеток или клеточных органелл. В основе программы лежат представления о молекулярной биотехнологии, которая служит для создания нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах с помощью биологических систем in vitro и in vivo. Рассмотрены вопросы практического применения молекулярной биотехнологии на примерах производства продуктов питания (выращивание водорослей, дрожжей и бактерий для получения веществ, повышающих биологическую и энергетическую ценность пищи), повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и животных, производства фармацевтических субстанций, биологической очистки объектов окружающей среды, совершенствования лабораторных методов обследования биологических объектов экосистем. Программа основана на учебно-исследовательском принципе изучения предмета.

Весь материал разбит на 4 раздела. В первом разделе излагаются основы молекулярной биологии, во втором – основной упор сделан на молекулярную биотехнологию микроорганизмов, в третьем – рассмотрены вопросы биотехнологии эукариотических систем, в том числе и человека и в четвертом разделе приведена законодательная база использования генноинженерных продуктов в пищевой и фармацевтической промышленности, применения рекомбинантных организмов в сельском хозяйстве, понятия о правилах GMP и GLP (требования производства генноинженерных продуктов и их добротного испытания).

При изложении теоретических основ спецкурса автор широко использовал шесть учебных пособий: Б.Глик, Дж.Пастернак «Молекулярная биотехнология. Принципы и применение». М.: Мир, 2002. – 589 с.; Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина «Основы биотехнологии». М.: ACADEMA, 2003. – 208 с.; О.В. Кислухина «Ферменты в производстве пищи и кормов». М.: ДеЛи принт, 2002 – 336 с.; В.Н.Голубев, И.Н.Жиганов «Пищевая биотехнология». М.: ДеЛи принт, 2001. – 123 с.; А.Н.Евтушенков, Ю.К.Фомичев «Введение в биотехнологию». Мн: БГУ, 2004. – 93 с.; И.В.Семак «Инженерная энзимология». Мн.: БГУ, 2006. – 126 с.

Все замечания и предложения будут с благодарностью приняты и учтены в дальнейшей работе по совершенствованию спецкурса

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Для специальности 1-31 01 01 – Биология рекомендуется учебная программа № ТД-G.005/тип., составленная доктором медицинских наук профессором Ю.К.Фомичевым, доктором биологических наук профессором В.А.Прокулевич и кандидатом биологических наук доцентом Р.А.Желдаковой; для специальности 1-33 01 01 Биоэкология и 1-02 04 04-01 – Биология. Химия используется программа «Основы биотехнологии» д ля студентов биологических факультетов университетов, разработаная заведующим кафедрой химии Витебского государственного университета им. П.М. Машерова доктором биологических наук, профессором Чиркиным А.А.

ЗАДАЧИ ПРЕПОДАВАНИЯ КУРСА

В результате изучения основ биотехнологии студент должен:

знать

- биологические агенты, используемые в биотехнологии;

- принципы культивирования клеток;

- сущность методов молекулярной генетики, а также технологии рекомбинантных ДНК;

- принципы работы с иммобилизованными ферментами;

- этапы выделения целевых продуктов и возможные пути загрязнения внешней среды

уметь

- пользоваться языком молекулярной биотехнологии и справочными руководствами;

- выбрать биологический объект, составить алгоритм биотехнологических работ, обосновать метод наиболее эффективной очистки целевого продукта;

- применить методы спектрофотометрии, тонкослойной и колоночной хроматографии, определения активности и количества ферментов, выделения и очистки целевого продукта.

СОДЕРЖАНИЕ КУРСА

История молекулярной биотехнологии. Молекулярная биотехнология как разделы молекулярной биологии, молекулярной генетики бактерий, энзимологии, с одной стороны, и промышленной микробиологии и химической инженерии, с другой. Цели молекулярной биотехнологии: повышение урожайности сельскохозяйственных культур, создание микроорганизмов, продуцирующих различные химические соединения, создание пород сельскохозяйственных и других животных с улучшенными наследуемыми признаками, переработка отходов, загрязняющих окружающую среду, получение продуктов питания и повышение биологической ценности пищи, получения низкомолекулярных биорегуляторов и биополимеров для применения в фармации и медицине. Возможные негативные эффекты развития молекулярной биотехнологии.

Ферменты в молекулярной биотехнологии. Иммобилизованные ферменты.

I. Биологические системы, используемые в молекулярной биотехнологии: прокариоты, эукариоты; бактерии Escherichia coli, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, культуры эукариотических клеток (насекомых, растений, млекопитающих). Ферменты. Требования, предъявляемые к биообъектам. Культивирование, основные компоненты питательных сред. Принципы селекции микроорганизмов. Биотехнологическое сырье, учитывая побочные продукты производства. Источники минерального питания. Комплексные обогатители сред. Среды для культивирования микроорганизмов. Кислород и вода. Пенообразователи и пеногасители. Значение асептики в биотехнологии.

Матричные синтезы: репликация, транскрипция, трансляция. Особенности регуляции транскрипции у бактерий и эукариот. Представления о технологии рекомбинантных ДНК. Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотические клетки. Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем. Дрожжевые системы экспрессии. Системы экспрессии с использованием культур клеток насекомых (рекомбинантные бакуловирусы). Системы экспрессии для работы с клетками млекопитающих.

II. Биотехнологический процесс культивирования микроорганизмов. Рост и развитие микроорганизмов. Основные показатели процесса ферментации. Оновные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов. Оценка процесса ферментации. Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов. Этапы роста культуры – латентная, ускорения, логарифмическая, замедления, стационарная, отмирания (преимущественный синтез белков в логарифмической фазе, а низкомолекулярных продуктов – во время стационарной фазы). Типы биореакторов: с механическим перемешиванием, барботажные колонны, эрлифтные.

Инженерная энзимология. Строение ферментов, катализ, выделение ферментов. Источники ферментов (животного происхождения, растительного происхождения). Иммобилизованные ферменты.

Утилизация крахмала и сахаров, повышение эффективности производства фруктозы и этанола. Бродильные производства (алкогольные напитки, пиво, вино, спирт, сидр, уксус). Мультиплазмидные организмы, способные утилизировать несколько соединений. Утилизация целлюлозы через выделение прокариотических и эукариотических целлюлазных генов. Повышение образования силоса с использованием Lactobacillus plantarum. Белок одноклеточных организмов (БОО) – белковые продукты, синтезируемые монокультурой микробных клеток и используемые в качестве пищевых добавок или корма для скота (подкислители, аминокислоты, витамины и пигменты, усилители вкуса, жиры и масла, растительный клей и загустители, подсластители, пищевые кислоты – уксусная, лимонная, молочная).

Пищевые аспекты биотехнологии: получение пищевого белка, молочные продукты (казеины, казеинат натрия, казецит и копреципитаты, концентраты сывороточных и других белков, методы приближения молочных смесей к женскому молоку, брожение лактозы и коагуляция казеина, производство кисломолочных продуктов, сычужное свертывание молока и производство сыра), хлебопродукты, бродильные производства, пищевые добавки, консервированные овощи (продукты из сои, применение ферментов при выработке фруктовых соков).

Границы применения биотехнологии в пищевой промышленности. Перспективы использования продукции биотехнологии: аминокислоты, олигопептиды, ферменты, витамины, терпены и родственные соединения, органические кислоты, полисахариды.

Представление о биогеотехнологии (обогащение полезных ископаемых и удаление мешающих и опасных веществ, увеличение добычи нефти) и о биоконверсии энергии (биофотолиз воды, биогаз, биологические топливные элементы).

Бактерии, стимулирующие рост растений: непосредственно путем поставки фиксированного азота, хелатированного железа, фитогормонов, фосфатов (штаммы Rhizobium, симбиоз с растениями, клубеньки на корнях) и опосредованно через подавление роста фитопатогенных микроорганизмов.

Микробные инсектициды. Токсины, синтезируемые Bacillus thuringiensis, клонирование генов токсинов и возможность их экспрессии. Бакуловирусы как инсектицидные агенты (введение гена нейротоксина, смертельного для насекомых).

Методы иммунодиагностики: ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Микробиологическое производство лекарственных средств: интерфероны, соматотропин, моноклональные антитела как лекарственные средства, производство антител с помощью E.coli, перспективы лекарств против ВИЧ. Вакцины – субъединичные, аттенуированные, «векторные».

Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения низкомолекулярных соединений – витаминов, аминокислот, антибиотиков и др. Микробиологический синтез каучука.

Биодеградация токсичных соединений и утилизация биомассы. Метаболические пути биодеградации ксенобиотиков.

III. Культуры растительных клеток и тканей. Фертильные растения, все клетки которых несут чужеродный(е) ген(ы) (трансгенные растения). Получение трансгенных растений не содержащих маркерных генов. Выведение растений, устойчивых к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам. Получение растений, противостоящих неблагоприятным воздействиям и старению. Изменение свойств растений: окраски цветков, пищевой ценности, вкуса, внешнего вида плодов. Трансгенные растения, способные синтезировать ценные для промышленности и сельского хозяйства белки и химикаты.

Трансгенные животные (молочная железа – «биореактор», наследуемая устойчивость к бактериальным, вирусным инфекциям и паразитарным инвазиям); трансгенные овцы, козы и свиньи (синтез человеческого гемоглобина); трансгенные птицы, рыбы. ПЦР как метод обнаружения трансгена, перспективы и потенциальные опасности.

IV. Контроль применения биотехнологических методов: экспериментов с рекомбинантными ДНК, производства и потребления пищевых продуктов и пищевых добавок, высвобождения генетически модифицированных организмов в окружающую среду. Общее представление о правилах добротного и безопасного производства (GMP – Good Manufacturing Practice), доклинического испытания (GLP – Good Laboratory Practice) и клинического испытания (GCP – Good Clinical Practice) продуктов молекулярной биотехнологии, применяемых для улучшения качества жизни человека.

Количество часов по дисциплине

Примечание: КСР – контролируемая самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя.

ПРИМЕРНЫЙ ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН ЛЕКЦИЙ ДИСЦИПЛИНЫ «ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИ» ДЛЯ СТУДЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ»

ИТОГО: Лекции 32 часов.

ПРИМЕРНЫЙ ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН ЛАБОРАТОРНЫХ ЗАНЯТИЙ ДИСЦИПЛИНЫ «ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ»

Литература

Основная литература

Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. М.: «Академия», 2003.

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: “Мир”, 2002.

Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. М.:ДеЛи принт, 2001.

Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. Санкт-Петербург: ГИОРД, 2003.

Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию. Минск: БГУ, 2004.

Кислухина О., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья. Каунас: «Технология», 1997.

Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. М.: ДеЛи принт, 2002. – 336 с.

Семак И.В. Инженерная энзимология. Минск: БГУ, 2006.

Фомичев Ю.К., Прокулевич В.А., Желдакова Р.А. Основы биотехнологии. Учебная программа для высших учебных заведений по специальности 1-31 01 01 Биология. Минск, 2006.

Чиркин А.А. Практикум по биохимии. Минск: ООО «Новое знание», 2002.

Чиркин А.А. Введение в биотехнологию. Витебск: Издательство УО «ВГУ им. П.М.Машерова», 2004.

Чиркин А.А. Основы генной инженерии: методы рекомбинантных ДНК. Витебск: Издательство УО «ВГУ им. П.М.Машерова», 2005.

Дополнительная литература

Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. М.: "Мир", 1989.

Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. М.: "Агропромиздат", 1990.

Биотехнология, в 8-ми томах. Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. М.: "Высшая школа", 1987-1988.

Гриневич А.Г., Босенко А.М. Техническая микробиология. Мн.: "Вышэйшая школа", 1986.

Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПБ: "Наука", 1995.

Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов. М.: «Высшая школа», 1990.

Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: биотехнологические агенты, технология, аппаратура. Рига: "Зинатне", 1987.

Кулаковская Т.В. Лабораторный практикум по биотехнологии: Учеб. пособие. Мн.: БГПУ им. М.Танка, 2001. – 45 с.

Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.:Минздрав РФ, ЗАО «ИИА Ремедиум», 2000.

Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. СПб: СПбГТУ, 2002.

Юрченко Е.О., Синявская М.Г. Основы молекулярного маркирования грибной ДНК. Минск: ИООО «Право и экономика», 2007.

Harvey W. Blanch, Douglas S. Clark. Biochemical Engineering. N.-Y.:Marcel Dekker, 1997.

Wong C.H., White G.M. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry. Trowbridge: Pergamon, 1995.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ СОДЕРЖАНИЕ КУРСА

История развития молекулярной биотехнологии представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Историческая справка о становлении молекулярной биологии (по Б.Глик, Дж.Пастернак, 2002)

Термин «биотехнология» был предложен в 1917 году венгерским инженером Карлом Эреки для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология – это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». В 1961 году по инициативе шведского микробиолога Карла Герена Хеден было предложено название журналу «Биотехнология и биоинженерия», что определило официальное признание термина – биотехнология, т.е. наука в области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов». Фундаментом для этой науки явились микробиология, биохимия и химическая инженерия.

Промышленная биотехнология. Промышленный биотехнологический процесс, в котором для производства коммерческих продуктов используются микроорганизмы, обычно состоит из трех ключевых этапов.

1. Исходная обработка: обработка сырья таким образом, чтобы его можно было использовать как источник питательных веществ для микроорганизма-мишени.

2. Ферментация и биотрансформация: рост микроорганизма-мишени в большом (обычно более 100 л) биореакторе (ферментация) с последующим образованием нужного метаболита, например антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформация).

3. Конечная обработка: очистка нужного вещества от компонентов культуральной среды или от клеточной массы.

По Т.А.Егоровой и соавт. (2003) достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях:

1) в промышленности (пищевая, фармацевтическая, химическая, нефтегазовая) – использование биосинтеза и биотрансформации новых веществ на основе сконструированных методами генной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свойствами на основе микробиологического синтеза;

2) в экологии – повышение эффективности экологизированной защиты растений, разработка экологически безопасных технологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромышленного комплекса, конструирование экосистем;

3) в энергетике – применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделированных фотосинтетических процессов, биоконверсия биомассы в биогаз;

4) в сельском хозяйстве – разработка в области растениеводства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, микробиологических методов рекультивации почв; в области животноводства – создание эффективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукция животных на основе эмбриогенетических методов;

5) в медицине – разработка медицинских биопрепаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

В качестве примера на рис. 1 представлены современные направления биотехнологии, предназначенные для создания продовольствия.

Рис. 1. Перспективные направления биотехнологии в снабжении человечества продовольствием (Т.А.Егорова и соавт., 2003).

Будущее биотехнологии некоторые исследователи связывают с протоинженерией – технологией изменения свойств природных белков на генетическом уровне, получения новых белков (инсектицидов, биостимуляторов, биосенсоров, качественных продуктов питания, лекарств и др.). Так, например, использование биосенсоров лежит в основе биоэлектроники, призванной обеспечивать революционные изменения в методах измерений и контроля в различных областях науки и техники. Основная доля успехов биотехнологии в последние годы связана с развитием методов генной инженерии – технологии рекомбинантных ДНК. Согласно определению Национальных институтов здоровья США, рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки, в пробирке, путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с векторами, способными самореплицироваться в клетке.

Современные методы биотехнологических процессов: методы промышленной микробиологии, генная инженерия, использование иммобилизованных ферментов, клеточных органелл, клеток, тканей растений, насекомых и животных.

Промышленная микробиология базируется на фундаментальных науках микробиология, иммунология и биохимия. В течение последнего столетия промышленная микробиология постепенно занимала передовые позиции в получении пищевых добавок и чистых биологически значимых веществ по сравнению с производствами, основанными на химическом синтезе. Существенным прорывом в развитии промышленной микробиологии явился синтез пенициллина и других антибиотиков. На одной из последних технологических схем синтеза пенициллина представлены типичные этапы биотехнологического процесса синтеза и выделения антибиотика (рис. 2). В промышленной микробиологии важную роль играют знания по энзимологии и генетике микроорганизмов, а также сведения по таксономии микроорганизмов.

Основу генной инженерии составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в вектор, который представляет собой бактериальную плазмиду или геном вируса; затем рекомбинантную молекулу ДНК вводят в клетку, где она реплицируется. Клетка, содержащая такую ДНК, размножается, образуя клон трансформированных клеток, способных к экспрессии чужеродных генов и образованию специфических белков в больших количествах.

Технология иммобилизованных ферментов получила свое развитие в последние 30-40 лет. Иммобилизованные ферменты на гелевых или пористых носителях оказались высокотехнологичными при промышленном ферментативном выделении или синтезе различных химических веществ, включая пищевые продукты (получение концентрата фруктозы из крахмала, этанола и др.).

В молекулярной биотехнологии определенное место занимает использование клеток животных, например, для культивирования вирусов при производстве вакцин, интерферона, при синтезе моноклональных антител клетками гибридом, получении сложных белков.

Рис. 2. Технологическая схема производства пенициллина (Т.А.Егорова и соавт., 2003).

Для широкомасштабного производства клонов растений используют меристемы. Культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ, чаще всего алкалоидов и других вторичных метаболитов. Начиная с 1970 г. исследователи нередко наблюдали, что клетки, растущие в культуре, синтезируют вещества, которые не обнаруживаются в целом растении.