История эпоксигидролаз

Открытие и история эпоксигидролаз млекопитающих напрямую связана со способностью синтезировать и описать соответствующие эпоксидные субстраты. Ранние работы над микросомальной гидролазой (mEH или EH1, EC 3.3.2.9) были возможны только благодаря одновременной работе над метаболитами циклодиеновых эпоксидов Герри Бруксом (Brooks et al., 1970; Morisseau and Hammock, 2008) и ароматических эпоксидов группой Джона Дэли (Jerina et al., 1968). Также и идентификация растворимой эпоксигидролазы (sEH, EH2, EC 3.3.2.10) была основана на исследованиях группы Джона Касиды характеризовавших метаболизм соединений имитирующих ювенильный гормон R-20458, который показал новую эпоксигидролазную активность в растворимой фракции гомогената печени (Grill et al., 1972; Grill et al., 1974). mEH и sEH показывают полную субстратную селективность и похоже являются основными эпоксигидролазами вовлеченными в гидролиз ксенобиотических эпоксидов в то время как sEH также является необходимой для гидролиза ЭЖК. Вместе sEH и mEH относятся к супергруппе гидролаз называемых альфа/бета гидролазами и имеются общие ключевые закономерности с двумя другими слабоизученными ферментами, называемыми EH3 и EH4 (Decker et al., 2009). В дополнение к эпоксигидролазам связанным генетическими закономерностями, две другие эпоксигидролазы млекопитающих были выделены по сродству к субстратам. Холестерол эпоксигидролаза (ChEH) была определена как уникальная микросомальная эпоксигидролаза которая гидролизует 5,6-холестерол эпоксид (Oesch et al., 1984; Sevanian and McLeod, 1986; Poirot and Silvente-Poirot, 2013) и лейкотриен А₄ гидролаза была определена по ее селективности к лейкотриену А₄ (LTA₄) (Maycock et al., 1982; Haeggstorm et al., 2007).

Открытие микросомальной эпоксигидролазы вовлеченной в метаболизм ксенобиотиков. Первое сообщение о эпоксигидролазе было опубликовано в 1970 году, когда Гэри Брукс работал над метаболизмом инсектицидов в млекопитающих и насекомых. В то время он знал, что окисление циклодиеновых инсектицидов давало стабильные и высокотоксичные эпоксиды и было показано что гидратация эпоксида диелдрина может происходить in vivo. Jerina et al. (1968) ранее показал что гидратация 1,2-нафтален оксида происходит в микросомах печени крыс; тем не менее описание фермента (mEH) ответственного за это еще не было сделано. В своей работе Брукс показал что гидратация хлорированных циклодиеновых эпоксидов осуществляется микросомальными ферментами (Brooks et al., 1970). Это привело Брукса к развитию гипотезы что ингибирование микросомальных эпоксигидролаз может привести к синергии. Содержащие эпоксигруппы циклодиеновые инсектициды были первыми использованы в его работе. Тем не менее скорость гидратации была настолько мала для этих инсектицидов с затрудненными эпоксигруппами что они не совсем подходили для исследования фермента. Брукс и его команда создали менее затрудненные и биоразлагаемые циклодиеновые эпоксиды. Этот субстрат 1,2,3,4,9,9-гексахлоро-6,7-эпокси-1,4,4а,5,6,7,8,8а-октагидро-1,4-метанонафтален (HEOM) гидролизовался значительно быстрее и мог быть определен методом газо-жидкостной хроматографии позволяя описать микросомальную эпоксигидролазу и разработать первые ингибиторы включая неконкурентный ингибитор 1,1,1-трихлорпропан-2,3-эпоксид (Brooks, 1973).

В то время как Брукс исследовал гидролиз эпоксидов в хлорированных инсектицидах, Дэли работал с Jerina и Oesch над метаболизмом ароматически углеводородов. Для Брукса открытие mEH было замедлено из-за того что эпоксиды, которые он исследовал, были чрезвычайно стабильными. Наоборот работа группы под руководством Дэли затруднялась неустойчивостью ароматических эпоксидов в водной среде. В это время Jerina определил и разработал механизм внутримолекулярной миграции водородных атомов путем гидроксилирования. В то же самое время он продемонстрировал превращение ароматических оксидов в серию метаболитов включая премеркаптановые производные и дигидродиолы. Некоторые ученые ранее получали дигидрокси метаболиты из нафталена или аналогичных ароматических соединений (Young, 1947; Smith et al., 1950), однако Jerina был первым кто предположил эпоксидный интермедиат и ферментативное превращение эпоксидов в диолы. Он позже расширил свои исследования на бензопирены синтезировав все потенциальные метаболиты чтобы подтвердить какой интермедиат является сильнейшим канцерогеном. Результатом его работы стало подтверждение того что эпоксидиолы являются сильными мутагенами и создание теории «бухты», которая отличала метаболиты с эпоксидиолами в районе «бухты» молекулы как соединения с повышенной химической активностью которая приводит в наибольшей мутагенной активности.

В то время как Джерина работал над механизмом токсичности ароматических эпоксидов, Ош провел первую работу по идентификации серии субстратов и ингибиторов. Как успех Брукса полагался на создание быстрого ГЖХ метода c HEOM, успех Оша во многом зависел от синтеза меченого стирен оксида который стал отличным субстратом для эпоксигидролазы в микросомальной фракции. Хотя этот эпоксид стирена был относительно нестабильным, склонным к полимеризации, взаимодействовал с тиолами и был подвержен действию нейтральных и кислых сред его было значительно проще использовать для рутинных экспериментов чем ароматические оксиды. Ош, благодаря тому что стирен оксид растворялся в петролейном эфире, а производный от него диол в воде, смог создать простой метод для mEH который расширил исследования данного фермента. К несчастью относительно основная среда, которая была оптимальной для микросомальной эпоксигидролазы отсрочила открытие эпоксигидролазной активности в водной фракции.

Разработка аналогов ювенильного гормона или ювенойдов. Циклодиеновые инсектициды, исследуемые Бруксом доказали свою значимость и стали широко распространены, но многие их них были широкого спектра, неразлагаемыми, токсичными и загрязняющими окружающую среду. Статья «Весна без звуков» Рэйчел Карсон (1962) привела к поиску более дружественных к природе пестицидов, которые бы не обладали проблемами неразлагаемых хлорорганических соединений и нецелевой токсичностью фосфорорганики. Кэрол Вильямс ввела термин «Пестициды третьего поколения» как вещества достигающие такие цели и нацеленные на разработку веществ копирующих ювенильный гормон насекомых, терпенойд контролирующий помимо всего рост и метаморфозы. Как ЭЖК млекопитающих, эти ювенильные гормоны были слишком дороги и нестабильны для эффективного использования в качестве инсектицидов. Эпоксид ювенильного гормона рассматривался некоторыми группами как выход и были получены его аналоги включающие амидные, азаридиновые, эфирные, мочевинные и алкоксидные группы в двух самых ранних сериях. Один из таких алкоксидных аналогов от Zoecon Corp (сейчас Wellmark) ZR 515 или метопрен продолжает оставаться востребованным инсектицидов для борьбы с тлей, комарами и другими насекомыми. Другой аналог от Stauffer Chemical Company сохранил эпоксигруппу. Так в результате исследования этого регулятора роста насекомых была открыта растворимая эпоксигидролаза (Gill et al., 1972; Hammock and Quinstad, 1976).

Открытие растворимой эпоксигидролазы. В начале 1970-х Джон Касида отправил двух студентов Саржита Гилла и Брюса Хэммока исследовать метаболизм аналога ювенильного гормона от фирмы Stauffer или ювенойда R-20458. После его радиосинтеза был обнаруже метаболизм данного ювенойда в насекомых микросомальной эпоксигидролазой, которую позднее назовут эпоксигидролазой ювенильного гормона (JHEH). С тех пор было обнаружено что ювенильный гормон насекомых регулируется не только биосинтезом, но и деградацией (Hammock, 1985) наблюдение ставшее важным в последующих исследованиях регулирование ЭЖК в млекопитающих. Работа над метаболизмом природных гормонов насекомых привела к синтезу большого числа соединений аналогов эпоксидов. Один из них ранее указанный остается коммерческим продуктом метрофеном. Уроки полученные в этом исследовании помогают получать аналоги ЭЖК.

Как можно заметить окислительный метаболизм млекопитающих R-20458 in vivo и in vitro приводило к множеству метаболитов получаемых от комбинации омега-гидроксилирования, аллильного гидроксилирования, циклизации и других реакций. Тем не менее, в гомогенатах печени в отсутствие НАД был найден единственный метаболит диол и найден он был в основном в водной фракции (Gill et al., 1972). Так как считалось что гидратация происходит благодаря единственному ферменту находящемуся в микросомальной фракции необычно было обнаружить что большая часть катализа происходит в растворенной фракции. Позднее было доказано что небольшой гидролиз R-20458 в микросомальной фракции был обусловлен попаданием следов sEH с эноплазматической ретикулой. В конце концов именно устойчивость R-20458 к глутатиону и высокая селективность sEH к таким тризамещенным эпоксидам привело к открытию новой эпоксигидролазы отличной от mEH.

Причины того почему исследователи проглядели sEH описаны в ряде статей (Ota and Hammock, 1980; Morisseau and Hammock, 2008). Гилл, Хэммок и Касида неверно полагали что sEH была незамечена из-за того что она показала высокую селективность к тризамещенным эпоксидам (Gill et al., 1974; Hammock et al., 1976). Это было основано на тщательном прочтении статьи лаборатории Кори из Гарварда, которая подтверждала наличие фермента гидролизующего тризамещенные оксиды сквален и подобные соединения (Dean et al., 1967). Основываясь на этой работе можно утверждать что лаборатория Кори первой сообщила о sEH, но дальнейшие исследования sEH в Гарварде закончились когда группа переключилась на чисто микросомальные работы (Morisseau and Hammock, 2008). Так было до тех пор пока не вышла работа Mumby and Hammock (1979) в которой было описано что sEH действительно превращает большинство моно-замещенных эпоксидов быстрее чем mEH и предпочитает цис и транс-1,2-дизамещенные эпоксиды в качестве субстратов больше чем три- и тетразамещенные эпоксиды. Ota and Hammock (1980) обнаружили что такая нестыковка была не из-за ошибок в ранних работах над mEH, где фермент обнаруженный в крысиной печени вместе с циклическими эпоксидами и окидом стирена в качестве субстратов и основной средой был микросомальным. Ошибка была связана с последующими обзорами и экстраполяцией первоначальных данных о mEH на другие виды, субстраты и условия эксперимента (Oesch and Daly, 1972; Gill and Hammock, 1980; Hammock et al., 1980a; Ota and Hammock, 1980). Ранние исследования использовали печень крыс в качестве модели, а лабораторная крыса имеет наименьший уровень sEH среди всех изученных млекопитающих (Gill and Hammock, 1980; Fornage et al., 2002). sEH не гидролизует эпоксиды в циклических системах (Moghaddan et al., 1997) и таким образом не была обнаружена в таких субстратах. Несмотря на то что sEH легко превращает оксид стирена, она была ингибирона субстратом и также была пропущена в этих исследованиях. Ирония состоит в том что похожие и более химически стабильные субстраты, такие как окись аллилбензола или транс-бета-этил стирен оксид быстро метаболизируются sEH (Ota and Hammock, 1980). Так как mEH наиболее активна в основной среде и такая же среда необходима чтобы повысить стабильность оксида стирена, именно такие условия обычно и использовали. В то же время такие условия минимизируют активность sEH. Проще говоря mEH и sEH имеют широкую и частично пересекающуюся селективность с тем что mEH эпоксиды в циклических системах и моно-замещенные эпоксиды, а sEH предпочитает 1,2-дизамещенные эпоксиды.

Вторая микросомальная эпоксигидролаза млекопитающих: ChEH. Биология и химия ChEH была ранее рассмотрена (Silvente-Poirot and Poirot, 2012; Poirot and Silvente-Poirot, 2013), так что история ChEH будет описана очень кратко. До выделения ChEH, было известно что 5,6-холестерол эпоксид ферментативно превращается в холестантриол (Black and Lenger, 1979; Sevanian et al., 1980; Watabe et al., 1980). Фермент ответственный за гидролиз 5,6-холестерол эпоксида был определен как микросомальная эпоксигидролаза отличная от mEH на основании антигенности (Oesch et al., 1984) и селективности (Sevanian and McLeod, 1986). Несмотря на обилие работ по ферментативной активности и распределении ChEH в тканях (Astrom et al., 1986), только недавно была установлена ее молекулярная природа. К удивлению оказалось что молекулярная природа ответственная за активность ChEH была на деле антиэстрогеновым центром связывания (AEBS), мультидоменным протеином с высокой афинностью к фармацевтическому тамоксифену, который состоит из двух ферментов, 3-бета-гидроксистерол-дельта7-дельта8-изомеразы и 3-бета-гидроксистерол-дельта7-редуктазы, вовлеченных в синтез холестерола (de Medina et al., 2010). Ki ингибирования тамоксифеном ChEH равно 35 нмоль/л. Тогда как эффективная доза такмоксифена низко микромолярная, эпоксиды холестерола потенциально вносят вклад в его биологическую активность.

В течение многих лет предполагалось что 5,6-холестерол эпоксиды играют роль в карциногенезе (Petrakis, 1986; Poirot and Silvente-Poirot, 2013). Тем не менее ранние исследования показывают что хотя 5,6-холестерол эпоксид ковалентно соединяется с нуклеофильной ДНК (Blackburn et al., 1979; Sevanian and Peterson, 1984), 5,6-холестерол эпоксид относительно неактивен с нуклеофилами, образуя аддукты с меркаптоэтанолом и аминоэтанолом в условиях катализа (Paillasse et al., 2012). Несмотря на недостаток химической активности, данный фермент катализирует присоединение гистамина к 5,6-альфа-холестерол эпоксиду давая Дендрогенин А (DDA). Это соединение мощный подавитель опухолей, который индуцирует клеточную дифференциацию и также мощный селективный ингибитор ChEH (de Medina et al., 2009; de Medina et al., 2013). DDA был обнаружен в тканях млекопитающих и в значительно меньших количествах в тканях пораженных раком груди. Он показал значительное увеличение времени жизни мышей с имплантированными опухолями (de Medina et al., 2013). Предполагая что недиольные метаболиты 5,6-холестерол эпоксида участвуют в повышении выживаемости при опухолях, было установлено что тамоксифен и DDA могут вместе снижать опасность рака за счет базового механизма ингибирования ChEH (de Medina et al., 2013). Воздействие на ChEH может дать новый терапевтический подход схожий с действием тамоксифена, но с меньшими побочными эффектами.