Метод кариологического анализа хромосом

Методкариологического анализа хромосом предназначен для определения стабильности кариотипа культур клеток в соответствии с требованиями к кариологическим параметрам видовой идентификации клеток, основанной на сравнении кариотипа испытуемого образца со стандартным образцом с нормальным кариотипом известного вида. Совпадение по кариотипу испытуемого и стандартного образцов позволяет заключить, что испытуемый образец принадлежит данному виду.

Кариологический анализ хромосом проводят на фиксированных препаратах в период митотической активности клеток, используя методы дифференциального окрашивания (С, G, Q и R методы, описанные ниже).

Получение препаратов для кариологического анализа хромосом. Испытуемые клетки в концентрации от 1,5х10⁵ до 2,0х10⁵ в 1,0 мл выращивают во флаконах при температуре 36±1°С. Через 36-48 ч после посева клеток во флакон вносят колхицин из расчета 0,1 мл 0,04% раствора на 1 мл питательной среды и оставляют при температуре 36±1 °С. Через 4-5 ч питательную среду сливают, клетки снимают с подложки 0,25% раствором трипсина, центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе калия хлорида и оставляют на 20 мин при температуре 37°С. Затем к клеткам добавляют смесь для фиксации, состоящую из 3 частей метанола и 1 части ледяной уксусной кислоты. Клетки фиксируют при температуре от 8 до 10ºС в течение 30 мин. Смену фиксатора повторяют 2 - 3 раза с промежуточным центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.

Несколько капель суспензии в фиксаторе наносят на влажные и охлажденные до температуры от 8 до 10°С предметные стекла и высушивают в струе теплого воздуха.

Для выявления структурного гетерохроматина, локализованного в околоцентрических и центромерных районах хромосом, в коротких плечах акроцентрических аутосом и в длинном плече Y-хромосомы. применяют дифференциальное окрашивание С-методом.

Для подсчета модального класса и полиплоидии хромосом клетки окрашивают 1% раствором красителя азур-эозина по Романовскому-Гимза.

Дифференциальное окрашивание С-методом применяют для выявления структурного гетерохроматина, локализованного в околоцентрических и центромерных районах хромосом, в коротких плечах акроцентрических аутосом и в длинном плече Y-хромосомы.

Дифференциальное окрашивание G-методом применяют при выявлении структурных перестроек и для идентификации маркерных хромосом. Метод позволяет идентифицировать каждую хромосому.

Дифференциальное окрашивание Q-методом применяют для идентификации Y-хромосомы и структурных перестроек. Он основан на окрашивании флюорохромами с двумя производными акрихина – акрихин-дигидрохлоридом и акрихин-ипритом с исследованием в люминисцентном микроскопе.

Дифференциальное окрашивание R-методом выявляет различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом, что подтверждает специфичность и стабильность рисунка полос для каждой хромосомы.

Отбор клеток, находящихся в метафазе, для подсчета полиплоидии и выявления аберраций хромосом, следует проводить по принципу общей цитологической пригодности.

Частоту полиплоидии (2n, 4n и т.д.) в популяции делящихся клеток определяют под микроскопом на основании подсчета в метафазных пластинках.

Точный подсчет хромосом и изучение структурных нарушений проводят с масляной иммерсией (объектив микроскопа 90х).

При цитогенетическом анализе, как правило, учитывают: число исследованных метафаз, число аберраций, число аберрантных клеток, типы аберраций и их частоту, распределение аберраций по группам хромосом. Для изучения клеточных культур банка рабочих клеток необходимо исследовать как минимум 500 метафазных пластинок на уровне производственного или любого следующего пассажа на чистоту полиплоидии, провести точный подсчёт хромосом, определить частоту разрывов хромосом, структурных нарушений, деспирализацию или заметное ослабление первичных или вторичных перетяжек. Для определения кариотипа отбирают метафазные пластинки для последующей компьютерной обработки препаратов.