Диагностика на лейкоз КРС – РИД

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет.

Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом или образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.

Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.

Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.

Факторами передачи являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.

Заражение также может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.

Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).

Из числа положительно реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического метода выявляют больных лейкозом.

Реакция иммунодиффузии (РИД). Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.

Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 суток до отела или через 30 суток после него.

Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.

Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы проволокой. После этого пробирки выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.

Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота, в состав которого входят: сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.

Оборудование и реактивы:

• чашки Петри диаметром 100 мм;

• стандартный штамп-пробойник для пресечения лунок в агаре;

• дозаторы со сменными наконечниками;

• рН-метр;

• осветитель;

• хлорид натрия (х.ч.);

• дистиллированная вода.

Постановка РИД. Подготовку компонентов реакции к работе осуществляют в соответствии с «Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота». Антиген растворяют в 5 см3 разбавителя. Растворенный антиген хранят при температуре 4°С не более двух недель.

Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см3, затем колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по 5 фигуры, каждая из которых состоит из 7 лунок: одна в центре, остальные по периферии.

Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры дозатором со сменными наконечниками.

Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1,2, 3,4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и ставят в термостат при T= 20 на 48 ч.

Учет и оценка результатов реакции. Реакцию учитывают не ранее, чем через 48 ч и не позднее, чем через 96 ч.

Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Реакцию оценивают только в том случае, если в геле агара между лунками сформирована четкая линия преципитации. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.

Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.

Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.

В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.

Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то есть идентична ей.

• если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном – слабоположительная сыворотка;

• если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном – резко положительная сыворотка.

Положительно реагирующая сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против второго антигена (р24) ВЛКРС.

При образовании толстой, короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку этой испытуемой сыворотки физ.раствором до получения результата, который можно будет оценить как отрицательный, положительный или неспецифический. Для этого необходимо физиологический раствор в объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведении). В первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания - в следующую и т.д.

В результате в первой пробирке или лунке испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй - в 4 раза, в третьей - в 8 раз и т.д.

Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без загиба.

В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.

Сдвиг контрольной линии преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в тест- системе. В этом случае необходимо использовать другую серию диагностического набора.

Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза и их необходимо исследовать гематологическим методом.

Схема постановки и оценки реакции иммунодиффузии в геле агара (РИД)

1- отрицательно реагирующая сыворотка, 2- положительно реагирующая сыворотка, 3- слабоположительная реагирующая сыворотка, 4- положительно реагирующая сыворотка со второй линией преципитации, 5- резко положительно реагирующая сыворотка, 6- положительно реагирующая сыворотка с неспецифической линией преципитации, 7- отрицательно реагирующая сыворотка с неспецифической линией преципитации, 8- отрицательно реагирующая сыворотка с зоной опалесценции, А- антиген онкорнавируса у КРС, КС- контрольная сыворотка против гликопротеидного антигена онкорнавируса КРС.