Структурно-функциональная организация и механизм работы атф-синтазного комплекса

Рентгеноструктурные и генетические исследования, проведенные в послед­ние годы, позволили выяснить пространственную организацию АТФ-синтаз­ного комплекса, предполагаемая структура которого дана на рис. 2.2 (см. гл. 2).

АТФ-синтаза хлоропластов представляет собой мембранно-связанный бел­ковый комплекс, который можно разделить на две части — CF₀ и CF₁. Сопря­гающий фактор CF₀ — это интегральный гидрофобный белок мембраны, вы­полняющий функцию протонного канала. У высших растений CF₀ состоит из 4 типов субъединиц: субъединица I осуществляет связь CF₀ с CF₁; субъединица II организует 12 копий субъединицы III, которые образуют олигомерное кольцо и, взаимодействуя с субъединицей IV, обеспечивают транслокацию Н из люмена в строму. Стехиометрический состав CF₀:I₁, II₁ III₁₂, IV₁. У Escherichia coli F_o (гл. 2, рис. 2.2) состоит из трех типов субъединиц: а_1, b_1, b'_1, С_9-12.

Сопрягающий фактор 1 (CF₁), водорастворимый белковый комплекс на стромальной поверхности мембраны, состоит из 5 типов субъединиц в соотно­шении α_3, β_3, γ, δ, ε. CF₁ содержит три каталитических центра синтеза АТФ, расположенных на трех β-субъединицах, и выполняет также структурную функцию, закрывая протонный канал мембраны. При удалении CF₁ с поверхности мембраны (обработкой растворами ЭДТА, бромида натрия) хлоропласта те­ряют способность к фосфорилированию, что обусловлено не только удалени­ем структур, несущих каталитические центры, но также увеличением протон­ной проводимости мембран и потерей их способности сохранять протонный градиент.

Три пары субъединиц α и β образуют гексамер (αβ)₃, который содержит каталитические и регуляторные центры. Субъединицы γ и ε формируют «ствол» АТФ-синтазы и играют ведущую роль в энергетическом сопряжении процес­сов транслокации протонов и работы каталитических центров. При вращении субъединиц γ и ε в ходе катализа конформационные сигналы передаются на пары субъединиц αβ. В результате этого происходит захват нуклеотидов (АДФ), синтезируется АТФ и высвобождается ранее синтезированная молекула АТФ.

Центральную роль в каталитическом процессе играет γ-субъединица. Регу­ляция каталитической активности фермента осуществляется при участии редокс-механизма, включающего обратимое окисление и восстановление дисульфидной связи в γ-субъединице CF₁. Субъединица ε выполняет также регуляторную функцию: будучи ингибитором АТФазной активности CF_1; она осуществляет кинетический контроль активности фермента. Субъединица δ участвует в связи CF₀ и CF₁: она ассоциирована с парой субъединиц айрис субъедини­цами I и II.

В соответствии с ротационной теорией Бойера (ротационный механизм де­тально описан в гл. 2, рис. 2.3) для нормального функционирования АТФ-синтазы необходимо прочное сопряжение процессов транслокации протонов, вращательного движения субъединиц ε и γ и взаимодействия их с (αβ)₃-гексамером.

Согласно ряду исследований (М. Futai et al., 2000), субъединицы III и IV (в CF₀) образуют единый комплекс, в котором субъединица IV совместно с субъединицами I, II и δ функционирует как статор, удерживающий (αβ)₃-гексамер, а 12 субъединиц III служат основанием ротора, сопряженным с субъ­единицами γ и ε. При транслокации протонов через каналы субъединицы IV и последовательном протежировании и депротонировании карбоксильной груп­пы аминокислоты (аспарагин-61) в каждой из 12 субъединиц III происходит вращение олигомера III с последующим переносом протона в стромальное про­странство. Движущей силой движения Н⁺ является трансмембранная разность протонных потенциалов в люмене (высокий) и строме (более низкий). Враща­тельное движение олигомера III благодаря аминокислотным контактам сопря­жено с вращением субъединиц γ и ε. Это вызывает их конформационные изме­нения с последующей передачей конформационных сигналов в каталитиче­ские центры субъединиц β благодаря взаимодействию α-спиралей субъединиц у с тремя субъединицами β.

Таким образом, в результате взаимодействия CF₀ и CF₁ осуществляется передача конформационных сигналов, индуцированных транслокацией про­тонов через мембрану при участии субъединиц III и IV. Функциональное со­пряжение между субъединицами осуществляется за счет ионизированных остат­ков аминокислот.

Структурная организация каталитических центров CF₁ исследована мето­дом рентгеноструктурного анализа. Показано, что три β -субъединицы имеют неодинаковую конформацию и их каталитические центры связывают разные нуклеотиды. Один из центров содержит АТФ (β _тф), другой — АДФ (β _ДФ), а в третьем нуклеотида нет (β_Е). Каталитические центры β -субъединиц, связанных с нуклеотидами (АТФ и АДФ), находятся в закрытой конформации, а центры β -субъединиц, не связанных с нуклеотидами, — в открытой конформации. При функционировании фермента имеет место переход от закрытой к откры­той конформации β _Е.

Основу гипотезы Бойера составляет идея кооперативности работы катали­тических центров, согласно которой каждый из трех каталитических центров последовательно проходит через три различных конформационных состояния в течение каталитического цикла (П. Бойер, 1993). Нуклеотидсвязывающие цент­ры β -субъединиц в ходе катализа взаимодействуют сопряженно и кооператив­но. Последовательная передача конформационных изменений от одних цент­ров к другим осуществляется путем изменения ориентации боковых цепей аминокислот в каждом каталитическом центре.

Механизм работы каталитических центров включает ряд этапов. Фермент содержит три кооперативно функционирующих каталитических центра. Кон­станта связывания субстратов

(АДФ + Ф_н) и продуктов реакции (АТФ) в каж­дом центре изменяется в ответ на энергозависимые конформационные изменения фермента. Изменения идут последовательно: первый этап — непрочное связывание АДФ и Ф_н (L-состояние), второй этап — прочное связывание субстратов с образованием АТФ и выделением Н₂О (Т-состояние), третий этап — энергозависимое освобождение прочносвязанной молекулы АТФ и свободная диссоциация АТФ (О-состояние) (см. рис. 2.3, гл. 2).

Главными участниками в реакциях синтеза АТФ в каталитических центрах являются фосфатная группа АДФ, неорганический фосфат и ион магния, образующий координационную связь с одной из аминокислот каталитиче­ского центра (рис. 3.39). В реакции синтеза АТФ р-фосфат АДФ и неоргани­ческий фосфат образуют связь с аминогруппой лизина-155, а также с магнием при участии треонина-156. В ходе катализа в результате конформационных изменений каталитического центра между β-фосфатом молекулы АДФ и неорганическим фосфатом возникает фосфоэфирная связь и синтезируется мо­лекула АТФ. Ангидридная связь при синтезе АТФ не требует специальных затрат энергии и образуется в результате резкого уменьшения константы рав­новесия реакции, обусловленного изменением микроокружения активного центра.

Согласно теории Бойера, энергия Δ используется для конформационных преобразований структур каталитического центра АТФ-синтазы, в результате которых изменяются константы связывания нуклеотидов. Это завершается синтезом АТФ из АДФ и Ф_н и освобождением молекулы АТФ из активного центра фермента.

Рис. 3.39. Синтез АТФ в каталитическом центре АТФ-синтазы на β-субъединице CF[ (no Futai et al., 2000, с изменениями)